CGRP對骺板生長發(fā)育影響及其調控機制的實驗研究.pdf

1、目的：脊椎動物骨骼的形態(tài)與大小因功能各異而相差懸殊，但多數(shù)骨骼卻是以相同的生長方式-軟骨內成骨-長成的。骺生長板（簡稱骺板）作為長骨生長代謝活躍區(qū)域，是軟骨內成骨的主要發(fā)生部位，其生長發(fā)育對肢體發(fā)育有重要作用。研究表明，降鈣素基因相關肽（CGRP）作為一種重要神經(jīng)肽，參與了骨折愈合的修復重建。臨床發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)癱患兒患肢發(fā)育明顯較健側短小畸形、骨質疏松，但周圍神經(jīng)對骨骼生長發(fā)育影響及調控機制有待進一步研究。
　　 本研究通過建立幼兔坐

2、骨神經(jīng)、股神經(jīng)損傷的動物模型，然后通過多種物理檢查及鏡下觀察的方法，比較實驗組和對照組之間脛骨骺板生長發(fā)育情況差異。并通過探討周圍神經(jīng)損傷后，以CGRP為代表的神經(jīng)肽對脛骨骺板生長發(fā)育的影響及其可能的調控機制，為從改善神經(jīng)功能入手來促進幼兒及青少年周圍神經(jīng)損傷者患肢生長發(fā)育提供理論依據(jù)。
　　 方法：選用健康的4～6周齡新西蘭大耳白兔40只，雌雄不限，體重1.0～1.4kg。采用同體對照法，將左側股神經(jīng)、坐骨神經(jīng)切除1cm作為實

3、驗組；右側不切除股神經(jīng)、坐骨神經(jīng)作為對照組。
　　 術后將實驗動物置于籠內，動物飼養(yǎng)選用標準飼料統(tǒng)一喂養(yǎng)，注意保溫，術后連續(xù)三天肌肉注射青霉素1萬單位/kg體重，每日2次，并應用碘伏隔日消毒傷口，預防傷口感染。分別在術后第1、2、4、8周隨機抽取8只實驗動物，空氣栓塞處死實驗動物，進行觀察：實驗動物處死前行X線攝像，觀察實驗動物X線下雙側脛骨的變化，測量雙側脛骨角并進行對比；處死實驗動物后，去除膝關節(jié)、踝關節(jié)周圍附著的肌肉及關節(jié)

4、囊，保留完整的脛骨，游標卡尺測量雙側脛骨的長度并進行對比；隨后置于雙能X線骨密度儀下測量，以脛骨干骺端為中心，對比進行干骺端骨密度檢測；將脛骨近端包括骨骺、骺板、干骺端一同取出分別行光鏡檢查，評價骺板軟骨內成骨骨形成及發(fā)育情況。整理數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學分析，得出統(tǒng)計學結論。
　　 結果：
　　 1.影像學檢查分別于脛骨正位X線片下，測量脛骨角，結果表明：術后1周實驗組及對照組脛骨角分別為90.78±2.53°、91.43±2

5、.60°，無統(tǒng)計學差異（p>0.05）；術后2周實驗組及對照組分別為87.43±1.05°、89.39±2.20°，有統(tǒng)計學差異（p<0.05）；術后4、8周結果均有統(tǒng)計學意義、且有顯著性差異（P<0.01）。
　　 2.脛骨長度測量游標卡尺測量雙側脛骨的長度，實驗結果表明：術后1周實驗組及對照組脛骨長度分別為93.96±1.78mm、95.01±1.85mm，無統(tǒng)計學差異（p>0.05）；術后2周實驗組及對照組分別為96.15

6、±1.70mm、100.00±3.83mm，有統(tǒng)計學差異（p<0.05）；術后4、8周結果均有統(tǒng)計學意義、且有顯著性差異（P<0.01）。
　　 3.脛骨干骺端骨密度測定
　　 取出雙側脛骨剝去骨周圍的軟組織，以脛骨近端干骺端為中心，置于雙能X線骨密度儀掃描下測量：術后1周實驗組及對照組干骺端骨密度分別為0.121±0.018g/c㎡、0.127±0.016g/c㎡，無統(tǒng)計學差異（p>0.05）；術后2周實驗組及對照組分

7、別為0.141±0.026g/c㎡、0.164±0.013g/c㎡，有統(tǒng)計學差異（p<0.05）；術后4、8周結果均有統(tǒng)計學意義、且有顯著性差異（P<0.01）。
　　 4.光鏡進行組織學觀察：光鏡下，對照組術后1、2、4周骺生長板軟骨細胞增殖分化明顯，結構層次清楚，依長骨的軸向縱向堆積呈柵欄狀排列整齊；8周軟骨細胞增殖分化減慢，仍可見軟骨繼續(xù)骨化。干骺端成骨區(qū)可見大量新生骨小梁，順應力方向呈縱向排列，骨小梁排列粗大，規(guī)則且逐漸

8、密集，周邊大量成骨細胞均勻排列，礦化類骨質堆積明顯。而實驗組術后1、2、4周骺生長板靜止軟骨區(qū)相對擴大，增殖肥大區(qū)相對縮小，結構層次排列紊亂，軟骨細胞增殖分化進行性減少；8周軟骨細胞排列嚴重紊亂，軟骨細胞增殖肥大層不明顯，軟骨內化骨停滯（骺板早閉）。成骨區(qū)骨小梁逐漸稀疏，細小，排列不規(guī)則，骨髓腔擴大，可見大量破骨細胞，未礦化類骨質大量堆積。
　　 5.CGRP免疫組化染色觀察，對照組術后1、2、4周骺板均可見大量CGRP陽性表達

9、，呈團塊狀散在均勻分布，染色呈深棕色；術后8周陽性表達相對減少，染色呈棕黃色。而術后1周實驗組骺板組織中可見少許CGRP陽性表達，呈散在點狀分布，分布稀疏，染色呈淺棕黃色；術后2、4、8周實驗組骺板中僅有極低水平的CGRP表達，進行性減少，染色呈淺黃色或淡黃色。
　　 結論：
　　 1.周圍神經(jīng)系統(tǒng)對骨骼生長發(fā)育起重要調節(jié)作用，骺板生長發(fā)育過程中CGRP的分布與骨代謝能力密切相關，表明，CGRP在骺板發(fā)育過程中發(fā)揮重要作

10、用。
　　 2.CGRP作為一種主要神經(jīng)肽，對骺板生長發(fā)育具有重要調控作用，CGRP通過復雜的網(wǎng)絡調節(jié)系統(tǒng)發(fā)揮其調控作用，但該網(wǎng)絡系統(tǒng)中各因素之間的協(xié)調/拮抗作用尚待進一步研究。
　　 3.周圍神經(jīng)損傷后，骺板局部CGRP等神經(jīng)肽分布減少，影響骺板正常發(fā)育，導致肢體短小畸形、骨質疏松。因此，恢復神經(jīng)支配是骨骼發(fā)育所必需的。
　　 4.幼兒及青少年周圍神經(jīng)損傷者，應盡早探查或修復周圍神經(jīng)，恢復肢體的神經(jīng)支配，以免延