輔助生殖技術(shù)對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育和血脂代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分體外受精對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其肝臟和骨骼肌Igf2/H19的表達(dá)與表觀遺傳修飾研究。
　　目的:
　　研究IVF小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、肝臟及骨骼肌印記基因Igf2、H19、Igf2r與微小RNA（microRNA，miRNA）的表達(dá)、以及Igf2/H19差異甲基化區(qū)(differentiallymethylated region，DMR)的甲基化狀況，闡明IVF對(duì)出生小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的

2、短期及中長(zhǎng)期效應(yīng)和發(fā)生機(jī)制。
　　材料和方法:
　　1.利用C57BL/6J小鼠建立IVF及體內(nèi)受精小鼠模型。比較IVF與體內(nèi)受精子代的妊娠率、胎仔數(shù)、懷孕天數(shù)、性別比率及死亡率。
　　2.以IVF子代為研究對(duì)象，以體內(nèi)受精子代為對(duì)照組，自出生第1天起至第10周性成熟期測(cè)量各組小鼠體重變化;于3周（斷乳期），10周（性成熟期），1.5年（老年期）取小鼠各器官，測(cè)量各組器官重量。
　　3.通過(guò)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)出

3、生、3周、10周及1.5年時(shí)期，肝臟及骨骼肌上印記基因Igf2、H19、Igf2r與miRNA-483的表達(dá)。
　　4.利用亞硫酸氫鹽PCR(bisulfite PCR，BSP)及克隆測(cè)序檢測(cè)IVF小鼠的H19DMR、Igf2 DMR2、Igf2r DMR2各位點(diǎn)的甲基化情況，再利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　5.通過(guò)western-blot技術(shù)，檢測(cè)出生、3周、10周及1.5年時(shí)期，肝臟及骨骼肌上IGF2蛋白的表達(dá)。

4、r>　　結(jié)果:
　　1.建立IVF及體內(nèi)受精小鼠各51只。兩組小鼠在妊娠率、胎仔數(shù)、懷孕天數(shù)、性別比率及死亡率上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.在出生時(shí)，IVF體重高于體內(nèi)受精組，而發(fā)育至2周及3周時(shí)，IVF體重顯著低于體內(nèi)受精組，3周后兩組的體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。器官重量，除去10周時(shí)IVF的脾臟重量低于體內(nèi)受精組，兩組小鼠的各器官重量在3周，10周，1.5年時(shí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.IVF對(duì)出生后子代肝臟及骨骼肌

5、Igf2/H19及miRNA-483表達(dá)的影響
　　(1)肝臟上Igf2/H19及miRNA-483表達(dá)分析
　　在出生及3周時(shí)，Igf2、H19與miRNA-483的表達(dá)在IVF組與體內(nèi)受精組之間存在差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10周時(shí)，Igf2、H19及miRNA-483的表達(dá)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但到老年時(shí)，Igf2、H19與miRNA-483的表達(dá)在IVF組與體內(nèi)受精組之間又出現(xiàn)差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段

6、，Igf2r的表達(dá)在兩組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)骨骼肌上Igf2/H19及miRNA-483表達(dá)分析
　　在3周時(shí)，Igf2、H19與miRNA-483的表達(dá)在IVF組與體內(nèi)受精組之間存在差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10周時(shí)，Igf2、H19及miRNA-483的表達(dá)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但到老年時(shí)，Igf2、H19與miRNA-483的表達(dá)在IVF組與體內(nèi)受精組之間又出現(xiàn)差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Igf2r的表達(dá)在3周

7、及10周時(shí)，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但在老年時(shí)，Igf2r的表達(dá)在IVF組顯著低于體內(nèi)受精組。
　　4.IVF對(duì)出生后子代肝臟及骨骼肌Igf2/H19 DMR與Igf2r DMR2甲基化的影響
　　依據(jù)上述Igf2及H19的長(zhǎng)期表達(dá)差異，選取H19 DMR的12個(gè)甲基化位點(diǎn)，Igf2DMR2的13個(gè)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行BSP并克隆測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn):H19 DMR的第6，7，8三個(gè)CpG位點(diǎn)，Igf2 DMR2的第4，5 CpG位點(diǎn)

8、在IVF組易出現(xiàn)甲基率的改變，因此，進(jìn)一步對(duì)H19 DMR第6到8 CpG位點(diǎn)，Igf2r DMR2的第1到5 CpG位點(diǎn)利用焦磷酸測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)選擇Igf2r DMR2的4個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化狀況分析。
　　(1)肝臟Igf2/H19 DMR與Igf2r DMR2的甲基化狀態(tài)分析
　　1)在出生時(shí)，H19 DMR的甲基化率在IVF組與體內(nèi)組之間存在差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在3周及10周時(shí)，H19 DMR的甲基化率在兩組之

9、間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但到1.5年時(shí)，H19 DMR的甲基化率在IVF組與體內(nèi)受精組之間又出現(xiàn)差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)在出生及3周時(shí)，Igf2 DMR2的甲基化率在IVF組與體內(nèi)組之間存在差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在10周時(shí)，Igf2 DMR2的甲基化率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但到1.5年時(shí)，Igf2 DMR2的甲基化率在IVF組與體內(nèi)受精組之間又出現(xiàn)差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3)在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，Igf2r DMR2的

10、甲基化率在兩組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)骨骼肌Igf2/H19 DMR與Igf2r DMR2的甲基化狀態(tài)分析
　　1)在3周時(shí)，H19 DMR的第6到8三個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化率在IVF組均顯著低于體內(nèi)受精組。但在10周及1.5年時(shí)，H19 DMR的甲基化率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)在3周時(shí)，Igf2 DMR2的甲基化率在IVF組與體內(nèi)組之間存在差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10周時(shí)，Igf2 DMR2的甲基

11、化率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但到1.5年時(shí)，Igf2 DMR2的甲基化率在IVF組與體內(nèi)受精組之間又出現(xiàn)差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3)在3周及10周時(shí)，Igf2r DMR2的甲基化率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在1.5年時(shí)，Igf2r DMR2的4個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化率在IVF組均高于體內(nèi)受精組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.IVF對(duì)出生后子代肝臟及骨骼肌IGF2蛋白表達(dá)的影響
　　在3周時(shí)期，無(wú)論是在肝臟還是骨骼肌，I

12、GF2蛋白的表達(dá)在IVF組均顯著低于體內(nèi)受精組。其它生長(zhǎng)發(fā)育階段IGF2蛋白的表達(dá)在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.IVF可影響子代的生長(zhǎng)發(fā)育，但隨著年齡的增長(zhǎng)，這種改變逐漸修復(fù)。
　　2.IVF不僅影響子代早期肝臟及骨骼肌Igf2、H19與miRNA-483的表達(dá)，還影響它們?cè)诶夏陼r(shí)期的表達(dá)。
　　3.IVF影響Igf2/H19的表達(dá)可能與它們的DMR區(qū)調(diào)控及miRNA-483相關(guān)，提示IVF可導(dǎo)

13、致表觀遺傳學(xué)的改變。
　　第二部分 ART老年小鼠血脂代謝的改變及其機(jī)制研究。
　　目的:
　　研究ART出生小鼠在老年時(shí)期的血脂代謝情況，探索ART對(duì)子代血脂改變的調(diào)控機(jī)制，明確ART致成年后疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，及闡明ART影響子代成年后健康的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)及致病時(shí)間窗。
　　材料和方法:
　　1.ART老年小鼠表型和血脂代謝檢測(cè)
　　(1)應(yīng)用已建好的ART老年C57BL/6J小鼠模型包括:12只IVF

14、小鼠、12只ICSI小鼠、10只IVM小鼠以及16只體內(nèi)受精小鼠（每組小鼠雌雄比率相似），分析各組小鼠的表型和血脂代謝等狀況。
　　(2)通過(guò)水迷宮及恐懼學(xué)行為實(shí)驗(yàn)，分析各組ART老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　(3)利用血壓檢測(cè)儀，檢測(cè)各組ART老年小鼠的血壓及心率情況。
　　(4)采用腹腔內(nèi)葡萄糖注射實(shí)驗(yàn)，對(duì)ART各組小鼠在老年時(shí)期血糖及糖耐量進(jìn)行檢測(cè)。
　　(5)利用生化分析儀，對(duì)ART各組老年小鼠血清進(jìn)行生

15、化分析包括血脂生化及肝腎生化。同時(shí)應(yīng)用ELISA技術(shù)，檢測(cè)各組老年小鼠血清胰島素水平。
　　(6)對(duì)各組ART老年小鼠的各器官進(jìn)行稱(chēng)量，并通過(guò)HE染色對(duì)ART小鼠的不同器官進(jìn)行病理學(xué)分析。
　　2.機(jī)制學(xué)研究
　　依據(jù)ART老年小鼠血脂代謝和器官病理改變的觀察結(jié)果，選擇脂類(lèi)代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路:胰島素誘導(dǎo)基因(insulin-induced gene，INSIG)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory

16、 element binding protein，SREBP)以及膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP），即INSIG-SCAP-SREBP為目標(biāo)基因，選取肝臟和肺臟為靶組織，進(jìn)行老年小鼠血脂代謝改變的發(fā)生機(jī)制研究。
　　(1) ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP基因表達(dá)分析
　　利用熒光及探針定量RT-PCR檢測(cè)ART老年小鼠肝臟和肺臟

17、組織Insig1，Insig2，Scap，Srebf1，Srebf2，miR-33與miR-122的表達(dá)變化。
　　(2) ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP基因修飾分析
　　應(yīng)用BSP及焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ART老年小鼠肝臟和肺臟組織INSIG-SCAP-SREBP的CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　(3) ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP蛋白表達(dá)分析
　　通過(guò)western-blot及免疫組

18、化等檢測(cè)INSIG-SCAP-SREBP各蛋白在肝臟和肺臟組織的表達(dá)情況。
　　(4) IVM的MⅡ卵母細(xì)胞INSIG-SCAP-SREBP表達(dá)分析
　　利用定量RT-PCR及免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)IVM的MⅡ卵母細(xì)胞INSIG-SCAP-SREBP基因及蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.ART老年子代的表型和血脂變化情況
　　(1)各組ART老年小鼠與體內(nèi)受精組相比較，學(xué)習(xí)記憶能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

19、>　　(2) IVM老年小鼠血壓顯著高于IVF組、ICSI組及體內(nèi)受精組，同時(shí)IVM組的心率顯著高于體內(nèi)受精組。IVF及ICSI組分別與體內(nèi)組比較，在血壓及心率上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3) ICSI組老年小鼠在進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)時(shí)，于葡萄糖注射30 min后血糖水平顯著低于體內(nèi)受精組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(4) IVM及ICSI組的血清生化分析提示:與體內(nèi)組比較，兩組老年小鼠在血膽固醇、血脂蛋白（LDL-C，HDL-

20、C及Apo-A）、血AST/ALT、血急性C反應(yīng)蛋白存在差異并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，IVM組的血清胰導(dǎo)素水平顯著高于體內(nèi)受精組。
　　(5) ICSI組及IVM組的腎臟和心臟重量均顯著高于體內(nèi)組及IVF組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，IVM組的胰腺及肝臟重量顯著高于其它三組。
　　(6) HE染色結(jié)果顯示:IVM組老年小鼠的腎臟存在脂類(lèi)改變;ICSI及IVF老年小鼠肺臟均存在炎性變化。
　　2.在肝臟上，各組ART老年小鼠

21、INSIG-SCAP-SREBP的表達(dá)變化
　　依據(jù)上述血清生化分析結(jié)果，血脂改變主要發(fā)生于ICSI組及IVM組，因此肝臟組織血脂代謝研究以ART老年子代包括IVF組、ICSI組及IVM組為研究對(duì)象，以體內(nèi)受精子代為對(duì)照。
　　(1) mRNA水平:Insig1，Scap，Srebf1，Srebf2基因的表達(dá)在IVM及ICSI組的表達(dá)均顯著高于IVF組及體內(nèi)受精組(2-4倍，P＜0.01)。另外，在IVM組及ICSI組，mi

22、R-33及miR-122表達(dá)均顯著低于IVF及體內(nèi)受精組。
　　(2) DNA水平:Insig1，Scap，Srebf1，Srebf2的CpG島的甲基化位點(diǎn)在IVM與ICSI組均與體內(nèi)組存在甲基化率的差異，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3)蛋白水平:IVM組及ICSI組的SCAP蛋白表達(dá)顯著高于IVF組及體內(nèi)受精組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.在肺臟上，各組ART老年小鼠INSIG-SCAP-SREBP的表達(dá)變化
　　依

23、據(jù)上述組織病理學(xué)結(jié)果，肺部炎癥病變主要發(fā)生于IVF組及ICSI組，因此肺臟組織研究以ART老年子代包括IVF組及ICSI組為研究對(duì)象，以體內(nèi)受精子代為對(duì)照;
　　(1) mRNA水平:Insig1，Insig2，Scap，Srebf1，Srebf2基因的表達(dá)在ICSI及IVF組的表達(dá)均顯著低于體內(nèi)受精組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2) DNA水平:Insig1，Scap，Srebf1，Srebf2的CpG島的甲基化位點(diǎn)在IVF

24、與ICSI組均與體內(nèi)組存在甲基化率的差異，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尤其是在病理肺臟上，各基因的甲基化率存在顯著變化。
　　(3)蛋白水平:western-blot及免疫組化結(jié)果顯示，IVF及ICSI組與體內(nèi)受精比較，各蛋白無(wú)差異。
　　4.IVM的MⅡ卵母細(xì)胞INSIG-SCAP-SREBP的表達(dá)變化
　　依據(jù)上述表型及血脂結(jié)果，血壓及血脂變化主要發(fā)生于IVM組，因此卵子研究以400個(gè)IVM的MⅡ卵母細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，400個(gè)體

25、內(nèi)成熟卵子為對(duì)照。
　　(1) mRNA水平:Insig1，Scap，Srebf1基因的表達(dá)在IVM卵子上的表達(dá)顯著高于體內(nèi)成熟卵子，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，IVM卵子的miR-33及miR-122表達(dá)顯著低于體內(nèi)成熟卵子。
　　(2)蛋白水平:INSIG1蛋白及SCAP蛋白在IVM卵子與體內(nèi)成熟卵子之間，表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.IVM可影響子代老年時(shí)期的血壓。
　　2.IVM及ICSI