羅氏沼蝦兩種不同的熱休克蛋白70分子生物學(xué)特征和功能.pdf

1、本研究以具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的淡水蝦類(lèi)-羅氏沼蝦作為研究對(duì)象，從35℃熱誘導(dǎo)后的中樞神經(jīng)和肝胰腺兩種組織中分別克隆到兩種熱休克蛋白70s基因，命名為Mar-HSC70和Mar-HSP70。氨基酸序列比對(duì)分析表明它們和其他物種HSP70s有很高的同源性，故確定它們屬于HSP70家族成員。研究中發(fā)現(xiàn)Mar-HSC70和Mar-HSP70氨基酸序列最主要的差別在于Mar-HSP70N-末端和C-末端分別有60和14個(gè)氨基酸殘基的缺失，而這種缺失經(jīng)

2、過(guò)多次測(cè)序得以確認(rèn)?；蚪M結(jié)構(gòu)分析表明這兩種HSP70s均不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。運(yùn)用Northernblotting、westernblotting和半定量RT-PCR分子生物學(xué)手段，從mRNA和蛋白兩種水平上分析了Mar-HSC70和Mar-HSP70在冷熱休克、重金屬誘導(dǎo)以及細(xì)菌侵染情況下它們的表達(dá)特征。　　為了進(jìn)一步分析這兩種分子在胞內(nèi)的表達(dá)情況，我們采用原位雜交和免疫組織化學(xué)在中樞神經(jīng)和肝胰腺兩種組織中進(jìn)行了表達(dá)定位研究?！　?/p>

3、了進(jìn)一步探討羅氏沼蝦這種誘導(dǎo)型Mar-HSP70的功能，我們構(gòu)建了Mar-HSP70-pET-28a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)，成功地表達(dá)了Mar-HSP70，發(fā)現(xiàn)在IPTG誘導(dǎo)5hr后，目的蛋白可達(dá)到細(xì)菌總蛋白的50％以上，同時(shí)通過(guò)免疫印跡技術(shù)證明了這種蛋白的免疫原性，而且通過(guò)優(yōu)化條件，采用低溫誘導(dǎo)，獲得了一定量可溶性Mar-HSP70。在Mar-HSP70功能分析中，我們建立了Mar-HSP70的活性檢測(cè)系統(tǒng)，在E.coliBL21(DE3