48298.β葡萄糖苷酶的分子生物學(xué)研究

1、北京師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要從多粘芽抱桿菌(Bacilluspolynyxa1.794)中克隆得到基因bgIA。將其構(gòu)建在大腸桿菌(Escherichiacal力表達(dá)載體P一葡萄糖普酶pET28a()上，轉(zhuǎn)化E.callBL21，獲得重組工程菌BL1979。重組表達(dá)的0一葡萄糖著酶的酶活力達(dá)到24.7工Uml，經(jīng)鎳柱純化后的旦一葡萄糖昔酶最適溫度為370C最適p日值為了.。，該酶經(jīng)純化后用非變性梯度聚丙烯凝膠電泳發(fā)現(xiàn)該酶具有多種寡聚體形

2、式，經(jīng)熒光底物活性染色表明這些寡聚體均具有0一葡萄糖普酶活性。將bg1A基因構(gòu)建在芽抱桿菌表達(dá)載體pWH1520上，采用不帶信號膚編碼序列但帶有自身核糖體結(jié)合位點(diǎn)的形式得到一重組質(zhì)粒pWH1520bg1A。以原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化巨大芽抱桿菌BM70，得到重組菌株BM1979，在有木糖誘導(dǎo)的情況下獲得了胞內(nèi)表達(dá)。用PCR方法從扣囊腹膜抱酵母(Sacchromycopsisfibuligera)的染色體DNA中克隆出0一葡萄糖普酶基因，構(gòu)建

3、了由酵母乙醇脫氫酶(ADH1)啟動(dòng)子和終止子引導(dǎo)表達(dá)，R一葡萄糖昔酶自身信號膚引導(dǎo)分泌，18srDNA序列介導(dǎo)的酵母整合型分泌表達(dá)質(zhì)粒AX2bgll。計(jì)劃以AX2bgll與酵母YEP型G418抗性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化野生型工業(yè)酒精酵母，把0一葡萄糖普酶基因整合到酵母染色體上并表達(dá)。該基因己在畢氏酵母中得到高效表達(dá)，對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，該酶最適溫度為500C，最適pH值為5.40關(guān)鍵詞:p一葡萄糖昔酶基因克隆表達(dá)北京師范大學(xué)碩士學(xué)位論文第一部分綜述

4、一纖維素酶在生物質(zhì)降解中的地位和作用1.1自然界中的纖維素資源纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生性資能源物質(zhì)，微生物對它的轉(zhuǎn)化降解，構(gòu)成了生物圈內(nèi)碳素和能量循環(huán)的主要組成部分。由于天然木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和物理結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，天然纖維素的生物降解也相應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種酶和蛋白因子的共同作用。影響纖維素生物降解效率的纖維素結(jié)構(gòu)特征主要有結(jié)晶度、伴生成分、表面積和聚合度。纖維素的聚合度很大，其聚合度可因來源的不同在10014000不等

5、，線形的纖維素大分子有規(guī)則地排列在一起，并且其糖上的輕基幾乎全部包含于氫鍵中，形成的總氫鍵能非常大。通過鏈內(nèi)和鏈間的氫鍵，加強(qiáng)了纖維素分子間的相互作用，使纖維素的微晶結(jié)構(gòu)很難打開。正是這些氫鍵的大量存在，使得纖維素分子鏈彼此高度牢固的鍵合在一起，成為剛性的高度不溶的微纖絲和纖絲。這是限制纖維素酶對其降解作用的一個(gè)主要限制因素(閻伯旭等，1995).植物纖維素是自然界最豐富碳水化合物資源。纖維素分子是由葡糖糖單體通過(14)糖昔鍵連接的線

6、性均聚物(圖1.1.1)。其分子長度依據(jù)來源和所遭受處理萬法不同而有很大差異。這些線性長鏈之間存在著大量氫鍵，賦予纖維素分子很高的剛性，抑制水解作用破壞糖昔鍵時(shí)所必須的分子撓曲。因此纖維素分子高度穩(wěn)定，尤其耐受化學(xué)攻擊。qH刃H了了‘，o一，0CHOHCHOHHO訣O0HHO召!﹄下書|HH|孟、、卜H01圖1.1.1通過5一(14)糖昔鍵聯(lián)結(jié)的葡萄糖長鏈構(gòu)成纖維素分子Figure1.1.1Linearstructureofcellul