紅笛鯛lck和tdt基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、魚(yú)類(lèi)T淋巴細(xì)胞酪氨酸激酶（Lymphocyte cell kinase，LCK）和末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）均是效應(yīng)T細(xì)胞形成的必要因子，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中具有重要作用，對(duì)其編碼基因在細(xì)菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，有助于揭示魚(yú)類(lèi)抗菌免疫的分子機(jī)制。本研究通過(guò)同源克隆和RACE技術(shù)獲得紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）lck和tdt基因序

2、列全長(zhǎng)，并利用免疫組織化學(xué)技術(shù)及原位雜交技術(shù)對(duì)其定位進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果如下：
　　1.lck和tdt基因全長(zhǎng)的獲得及序列分析：基因克隆獲得lck基因cDNA序列全長(zhǎng)為2279 bp，完整開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）為1506 bp，編碼501個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)分子量（MW）為57.4 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為4.98。tdt基因cDNA序列全長(zhǎng)為1710 bp，ORF為1392 bp，編碼463個(gè)氨基

3、酸。預(yù)測(cè)MW為52.6 kDa，理論pI為6.66構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，紅笛鯛lck和tdt分別與大菱鲆（Scophthalmus maximus）和尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）的相應(yīng)基因親緣關(guān)系較近。另外，PSORT II預(yù)測(cè)結(jié)果顯示lck編碼的蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)，幾率為39.1％，tdt編碼的蛋白主要分布于線粒體，幾率為60.9%。
　　2.lck和tdt基因不同組織差異表達(dá)分析：以β-act

4、in基因?yàn)閮?nèi)參，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，對(duì)哈氏弧菌 ZJ0706感染前后，紅笛鯛lck和tdt在肝臟、頭腎、脾臟、胸腺、小腸、肌肉、鰓絲、皮膚、心臟、中腎和腦共11個(gè)組織中的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果如下：lck在感染前后都能在頭腎、胸腺和脾臟中檢測(cè)到相應(yīng)mRNA的表達(dá)，且最大表達(dá)量都出現(xiàn)在誘導(dǎo)后36h；tdt在感染前后都能在頭腎和胸腺中檢測(cè)到相應(yīng)mRNA的表達(dá)，且最大表達(dá)量都出現(xiàn)在誘導(dǎo)后48h。
　　3.lck和tdt基

5、因定位分析：采用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究在蛋白水平上LCK和TdT的分布。利用pET-28a(+)和pET-32a(+)載體構(gòu)建pET28-LCK和pET32-TdT原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得LCK和TdT融合蛋白，并利用Western blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)的準(zhǔn)確性并制備鼠抗LCK和TdT多克隆抗體。結(jié)果顯示：LCK和TdT融合蛋白均可與鼠抗His-Tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明目的基因成功表達(dá)；通過(guò)ELISA檢測(cè)顯示LCK和TdT抗血清

6、效價(jià)均達(dá)到1：30000以上；抗血清能與LCK和TdT融合蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；利用上述抗血清進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，LCK蛋白主要分布于胸腺、頭腎及脾臟器官的淋巴細(xì)胞中，TdT蛋白主要分布于頭腎和胸腺器官的淋巴細(xì)胞。采用lck和tdt基因原位雜交技術(shù)研究LCK和TdT在mRNA水平的免疫器官的分布，結(jié)果顯示，lck mRNA在頭腎、脾臟和胸腺組織中的分布，且在胸腺中的信號(hào)最強(qiáng)烈，tdt mRNA在頭腎和胸腺組織中的分布,在胸腺中的信號(hào)