弧菌中整合接合元件的分子生物學(xué)特性研究.pdf

1、弧菌是水域環(huán)境中的條件致病菌,WHO明確了弧菌屬(vibrio spp)的危害人類的致病菌為12種,其中最常見的為:霍亂弧菌,副溶血性弧菌,溶藻弧菌。引起人類及漁業(yè)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病。近年來由于抗生素在環(huán)境中廣泛的存在導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性情況日益嚴(yán)重,給臨床治療帶來極大的困難,因此研究弧菌耐藥性機(jī)制對(duì)弧菌引起的疾病預(yù)防與治療起著重要作用。
　　整合接合元件(Integrating Conjugative Element,ICE)最早發(fā)現(xiàn)于一株

2、1992年印度爆發(fā)霍亂的流行菌株O139群霍亂弧菌,攜帶多種抗生素耐藥基因,在整合酶作用下,以整合接合的方式在其可變區(qū)或高頻插入位點(diǎn)攜帶外源基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體上,賦予宿主適應(yīng)環(huán)境的抗逆性基因,也可通過排斥系統(tǒng),阻止重復(fù)的ICE元件進(jìn)入到宿主細(xì)胞體內(nèi),因此研究ICE在環(huán)境細(xì)菌中的分布,ICE與宿主,ICE之間的相互作用,將對(duì)環(huán)境中細(xì)菌間基因的水平橫向傳播提供一定的理論依據(jù)。
　　本課題從水產(chǎn)品市場(chǎng),養(yǎng)殖水體及自然水域環(huán)境等各

3、水域環(huán)境中通過硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)培養(yǎng)基共分離菌株464株。選取甲氧氨芐嘧啶,鏈霉素,新諾明,氨芐西林,利福平,四環(huán)素,慶大霉素,氯霉素,卡那霉素,進(jìn)行九種不同抗生素的藥物敏感性實(shí)驗(yàn),其中分離菌總體對(duì)氨芐西林耐藥性最高,有49％的菌株對(duì)其有耐受性,對(duì)慶大霉素最敏感,3%的分離菌株對(duì)其有抗性。長(zhǎng)江入?？跇悠分蟹蛛x菌耐藥性最為嚴(yán)重,多藥抗性(MDR)菌株占71%,普陀區(qū)水產(chǎn)品市場(chǎng)樣品分離菌耐藥性情況較好,多藥抗性

4、菌株僅占8%。通過ICE保守基因的PCR檢測(cè)在對(duì)MDR菌株進(jìn)行篩選出含ICE的弧菌32株。所鑒定22株的霍亂弧菌全部且僅檢測(cè)出toxR毒力基因,3株副溶血性弧菌僅檢測(cè)出tlh毒力基因,1株溶藻弧菌僅檢測(cè)出毒力相關(guān)基因fur及valC基因,所鑒定的霍亂弧菌全部為非O1非O139型非致病性血清型,3株副溶血性弧菌也為非致病性血清型
　　通過使用參考文獻(xiàn)及自行設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ICE的5個(gè)保守位點(diǎn),整合酶基因Int,轉(zhuǎn)移酶基因traI,轉(zhuǎn)移酶

5、基因traC,調(diào)控基因setR,右側(cè)邊界序列attR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行測(cè)序和比對(duì),結(jié)果顯示本課題所研究 ICE在上述五個(gè)保守位點(diǎn)顯示出良好的保守性,其氨基酸序列與SXT/R391相似性高達(dá)97%以上。通過使用自行設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ICE的5個(gè)可變區(qū)(variable region,VR)及外源基因高頻插入位點(diǎn)(hotsopt,HS)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序比對(duì)顯示本課題所研究 ICE在可變區(qū)及高頻插入位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)攜帶耐藥性基因,提示宿主菌耐藥

6、性基因可能位于ICE其他位點(diǎn),亦有可能為其他機(jī)制所介導(dǎo)。本課題所研究ICE首次發(fā)現(xiàn)在HS4區(qū)域插入227Aa的脫氧核糖核酸酶,本課題所研究ICE在可變區(qū)及高頻插入位點(diǎn)部分及雜合(mosaic)插入已知ICE在相應(yīng)位點(diǎn)的序列,顯示出其多樣性。
　　根據(jù)參考文獻(xiàn)PCR擴(kuò)增eex及traG基因位點(diǎn),測(cè)序后進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)分析后顯示本課題所檢測(cè)的15個(gè)ICE元件中7個(gè)為S型,5個(gè)為R型,3個(gè)未能確定類型,未能確定類型的ICE元件與R/

7、S型ICE元件間的排斥類型有待進(jìn)一步的研究。通過對(duì)32個(gè)含ICE的宿主菌的藥物最小抑菌濃度值(MIC)的測(cè)定,選取帶有合適抗生素選擇性標(biāo)記的供體菌與不含有ICE及質(zhì)粒等可移動(dòng)基因元件但對(duì)氯霉素有抗性的E.coli MG1655作為受體菌進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本課題所研究的Vp25及Vc108菌株攜帶的ICE可通過接合介導(dǎo)抗生素抗性的轉(zhuǎn)移,初步驗(yàn)證了ICE元件在水域環(huán)境中介導(dǎo)抗生素抗性水平傳播的功能。
　　本課題針對(duì)初夏季節(jié)河豚魚的大