致病弧菌溶血素基因分子生物學原位檢測方法的研究.pdf

1、作為危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的魚類流行病,細菌性魚病雖然隨著致病因子的確定及其毒性研究的深入,以及免疫疫苗的成功研制,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的損害已有所降低.但是基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),使得水產(chǎn)學者們意識到新型致病菌的產(chǎn)生將是養(yǎng)殖業(yè)的一大隱患.基于這種情況,該實驗建立一套細菌致病因子的原位檢測技術(shù),為病原體致病基因在微生物群落中水平轉(zhuǎn)移的可能及其出現(xiàn)頻率的研究工作確立重要的研究手段.該實驗以純培養(yǎng)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic

2、us,Vp)為材料,以耐熱的直接溶血素基因(Thermostable direct haemolysin,tdh)為檢測對象,首先進行常規(guī)PCR的優(yōu)化實驗,獲得擴增tdh基因的最優(yōu)參數(shù);以常規(guī)PCR擴增確認菌體中tdh基因的存在,并輔以傳統(tǒng)的血平板進行溶血性實驗以確證結(jié)果;然后對菌體進行固定、溶菌酶處理等前處理步驟,并利用最優(yōu)參數(shù)對其進行原位擴增;產(chǎn)物上流式細胞儀檢測并輔以熒光顯微鏡檢測;最后在原位PCR-FC儀技術(shù)確立后,我們又對原位