海洋弧菌中五類溶血素基因分布及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、中國(guó)海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文海洋弧菌中五類溶血素基因分布及其生物學(xué)活性研究姓名：王淑嫻申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：海洋生物學(xué)指導(dǎo)教師：張曉華20070603海洋弧菌中五類溶血素基因分布及其生物學(xué)活性研究海洋弧菌中五類溶血素基因分布及其生物學(xué)活性研究摘要弧菌是海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的細(xì)菌類群之一，廣泛分布于近岸及河口海水、海洋生物的體表和腸道中，是海水和許多海洋生物的正?；蛴幸婢旱某蓡T。研究發(fā)現(xiàn)，許多海洋弧菌是養(yǎng)殖蝦類和魚類的重要病原菌。溶血素是病原

2、弧菌中分布最為廣泛的毒素之一，能夠?qū)е录t細(xì)胞膜的破裂并伴隨著血紅蛋白的釋放。某些細(xì)菌的溶血作用是由其產(chǎn)生的酶活性引起，如銅綠假單胞菌( P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 的磷脂酶C 和美人魚發(fā)光桿菌( P h o t o b a c t e r i u md a m s e l a e ) 的磷脂酶D ，而另一些細(xì)菌的溶血素是通過(guò)在紅細(xì)胞膜上的穿孔作用而產(chǎn)生溶血作用。有時(shí)溶血素的穿孔作

3、用不僅僅局限于紅細(xì)胞，還可以作用于多種其它類型的細(xì)胞，如肥大細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等，通過(guò)引起組織損傷而增加其毒性。盡管弧菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的各種溶血素均具有溶血活性，但它們的核苷酸序列、預(yù)測(cè)的氨基酸序列、活性以及作用機(jī)理卻不盡相同。目前發(fā)現(xiàn)5 類有代表性的溶血素家族，即副溶血弧菌( V i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ) 的熱穩(wěn)定性直接溶血素( T D H ) 、霍亂弧菌( 礦c h o l e

4、 r a e ) 的E l T o r 溶血素( H I y A ) 、副溶血弧菌的熱不穩(wěn)定性溶血素( T L H ) 、副溶血弧菌的熱穩(wěn)定性溶血素( 6 - V P H ) 以及0 1 型霍亂弧菌的一種溶血素( H L X ) 。本研究使用的5 7 株海洋弧菌包括2 6 株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，另有2 0 株哈維氏弧菌，1 1 株副溶血弧菌是從不同宿主和不同地理環(huán)境中分離得到的。從G e n B a n k 中獲取所有弧菌的5 類溶血素基因序

5、列，分別用C l u s t a i W ( h t t p ：／／w w w ．e b i ．a(chǎn) e ．u l d c l u s t a l w ／)進(jìn)行同緣比對(duì)。根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)5 對(duì)引物，分別擴(kuò)增T L H 、T D H 、H l y A 、6 - V P H和H L X 溶血素基因片段。使用D I G 探針合成試劑盒，分別以哈維氏弧菌( 礦h a r v e y i ) V I B6 4 5 、副溶血弧菌V I B6 1 1

6、、擬態(tài)弧菌( 礦m i m i c u s ) V I B 2 9 8 和副溶血弧菌V I B4 6 2 基因組D N A 為模板，P ．C R 合成地高辛標(biāo)記的溶血素基因T L H 、T D H 、H I y A 、6 ．V P H 和H L X 的部分序列，作為溶血素基因探針，檢測(cè)這5 類溶血素基因在5 7 株弧菌中的分布。結(jié)果顯示，在5 7 株弧菌中，含有T D H 、n i y a 、T L H 、6 ．V P H 和H L X