綿羊細粒棘球蚴病病理組織學觀察及EG95重組抗原體外表達研究.pdf

1、細粒棘球蚴病(Echinococcosis)又稱囊性包蟲病(cysticechinococcosis，CE)，是由處于細粒棘球絳蟲的幼蟲(續(xù)絳期)寄生于人體或某些動物體內(nèi)引起的人畜共患寄生蟲病，該病對人畜危害極為嚴重。細粒棘球蚴病呈全球性分布，主要在牧區(qū)、農(nóng)牧區(qū)流行，中國是該病的高發(fā)區(qū)。細粒棘球蚴病在我國的甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、青海、四川、陜西、西藏等西部、西北部省份尤為嚴重。該病嚴重威脅牛、羊等家畜以及人的身體健康，導致動物生產(chǎn)性

2、能嚴重下降，使我國畜牧業(yè)每年直接經(jīng)濟損失高達30多億元，是中國西部和西北部最嚴重的公共健康問題之一。目前對該病的控制主要以犬驅(qū)蟲和對牧民的預防教育等綜合性防制措施為主，但因種種因素限制，此舉措未獲得理想效果。通過疫苗預防將是控制該病的理想途徑之一。現(xiàn)代分子生物學、生物化學和免疫學新技術(shù)的發(fā)展及其在寄生蟲病疫苗研究中的應用，使棘球蚴病疫苗的研制取得了重大進展，基因工程重組抗原疫苗具有極大的應用價值。眾多研究表明，EG95蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的最

3、具保護作用的抗原，EG95重組基因疫苗也是近年來的研究熱點。
　　 從青海省某屠宰場搜集患細粒棘球蚴病綿羊，觀察內(nèi)臟器官病變，取寄生蟲包囊及其周圍肝臟、肺臟組織，進行石蠟切片、HE染色，進行組織病變觀察。結(jié)果顯示，細粒棘球蚴包囊的組織學結(jié)構(gòu)具有典型的寄生蟲肉芽腫特征；內(nèi)側(cè)為紅染的板層狀結(jié)構(gòu)；外側(cè)為特殊肉芽層，主要由上皮樣細胞構(gòu)成，可見多核巨細胞和少量的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤；而包囊壁最外層則由成纖維細胞及膠原纖維組成，其中有

4、大量淋巴細胞浸潤。包囊的形成對器官造成的損傷是多方面的，除包囊占位性病變造成的組織壓迫性萎縮外，并見肝臟間質(zhì)結(jié)締組織及膽管大量增生造成肝硬變，肝臟急性變性、過敏性炎癥等損傷性反應。肺臟可見間質(zhì)增生炎癥及囊液外滲引起的過敏性炎癥反應。
　　 從細粒棘球蚴病病羊的肝臟以及肺臟分離包囊，抽取囊液，離心取沉淀，分離基因組DNA，用PCR方法擴增NADH脫氫酶亞基1(ND1)基因并測序。通過GenBank中BLAST分析，結(jié)果顯示所獲ND

5、1序列與細粒棘球絳蟲(G1基因型)ND1序列相似性達99.9％，確定該地區(qū)流行的細粒棘球蚴為G1基因型，此法可用于細粒棘球蚴基因型的快速判定。
　　 取包囊囊液，沉淀原頭蚴，提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)從細粒棘球蚴中擴增了EG95基因cDNA，構(gòu)建了重組克隆載體pGEM-T-EG95cDNA，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，經(jīng)抗生素篩選獲得重組子并測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EG95基因cDNA序列與Genebank中公布的EG9

6、5基因cDNA序列(AY421719)編碼區(qū)未出現(xiàn)堿基差異，因而編碼的氨基酸未發(fā)生改變。
　　 通過一系列預測分析軟件對EG95基因以及蛋白的相關(guān)特性及抗原表位加以預測分析，同時根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計引物進行信號肽和疏水區(qū)的切除。分別用全長的EG95cDNA、切去信號肽和疏水區(qū)的EG95s構(gòu)建不同的重組表達載體。在E.coliRosetta(DE3)中誘導表達了預期大小的目的蛋白，其中既有以包涵體形式表達的EG95蛋白也有以可溶形式表