球孢白僵菌CXJ-1對棉蚜殺蟲機(jī)理及其應(yīng)用研究.pdf

1、棉蚜是近年來棉花發(fā)生的一種重要害蟲，我國棉蚜防治主要手段是化學(xué)防治，化學(xué)農(nóng)藥大量施用已經(jīng)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，使得該地區(qū)生態(tài)平衡受到破壞。使用環(huán)境友好的生物農(nóng)藥代替化學(xué)農(nóng)藥成為今后控制棉蚜的重要發(fā)展方向。球孢白僵菌是一種昆蟲病原真菌，具有不殺傷非目標(biāo)生物、安全、害蟲難以產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，在棉蚜生物防治過程中起到重要作用。
　　本研究以從新疆北部沙漠邊緣植物梭梭（H.ammodendron）上自然感染死亡的眩燈蛾（Lacydesspec

2、tabilis）上分離出兩株白僵菌為供試菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為球孢白僵菌（Beauveria.Bassiana），采用浸蟲法測定分離出兩白僵菌，命名為白僵菌CXJ-1和白僵菌CXJ-2，兩菌株在不同濃度下對棉蚜的室內(nèi)毒力活性實(shí)驗(yàn)，篩選出對棉蚜最具毒力活性菌株，即球孢白僵菌CXJ-1；通過正交試驗(yàn)法篩選出球孢白僵菌CXJ-1與化學(xué)殺蟲劑的最佳配方，以延緩棉蚜(Aphisgossypii)抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展；利用Placket

3、t-Burman法(PB)和響應(yīng)面法(RSM)，對球孢白僵菌CXJ-1發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了液體深層發(fā)酵中球孢白僵菌CXJ-1（BeauveriabassianaCXJ-1）的孢子量；由于幾丁質(zhì)酶在真菌和昆蟲的生理和發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，通過對球孢白僵菌CXJ-1幾丁質(zhì)酶理化特性和基因克隆研究，旨在為該菌對棉蚜的殺蟲機(jī)理提供酶學(xué)特性上的科學(xué)依據(jù)。主要研究成果如下：
　　1)采用浸蟲法測定白僵菌CXJ-1和CXJ-2菌株在不同

4、濃度下對棉蚜的室內(nèi)毒力活性，試驗(yàn)結(jié)果表明白僵菌CXJ-1和CXJ-2菌株在孢子濃度4.75×109個/mL對棉蚜死亡率分別達(dá)到92.12％和90.88%，致死中濃度分別為4.37×105個/mL和1.08×106個/mL，致死中時間分別為3.54d和3.59d。分離獲得的兩株球孢白僵菌對棉蚜均具有較好的毒力活性，其中菌株CXJ-1毒力活性比CXJ-2高。
　　2)本研究采用小區(qū)噴霧施藥法測定球孢白僵菌CXJ-1與吡蟲啉對棉蚜的殺蟲

5、作用，通過正交試驗(yàn)法篩選出球孢白僵菌CXJ-1孢子與吡蟲啉的最佳比例濃度。田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)孢子濃度為108cfu/ml與0.03g/L吡蟲啉混合時防治效果最好，11天對棉蚜死亡率達(dá)到82.15%，并對螨、瓢蟲和草蛉，死亡率分別為72.73%，55.56%和53.57%。球孢白僵菌孢子與吡蟲啉混合物對棉蚜具有較好的防治效果，可用于棉蚜防治。
　　3)采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了產(chǎn)孢發(fā)酵條件最適初始pH、發(fā)酵轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度。通過Pla

6、ckett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計響應(yīng)面分析優(yōu)化，確定了球孢白僵菌CXJ-1產(chǎn)孢最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：溫度28.07℃，轉(zhuǎn)速198.95r/min，初始pH6.10，預(yù)測孢子濃度可達(dá)0.95×107個/mL，在優(yōu)化發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，孢子濃度達(dá)到0.97×107個/mL，表明驗(yàn)證值和預(yù)測值有較高的擬合度。同上方法，確定了球孢白僵菌CXJ-1最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成：玉米淀粉8.03g/L、蕎麥粉14.20g/L

7、、玉米粉8.83g/L、NH4H2PO41.13g/L、牛肉膏1.03g/L、酵母提取物1.97g/L、KCl0.93g/L、MgSO40.63g/L、K2HPO41.77g/L、FeSO40.0077g/L，在此培養(yǎng)基組分下進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)值和模型預(yù)測值比較接近，有較高擬合度。球孢白僵菌CXJ-1孢子產(chǎn)量可達(dá)到5.81×107個/mL，比優(yōu)化前提高了7.02倍。
　　4)通過對幾丁質(zhì)酶理化性質(zhì)研究表明，該酶最適pH和最適溫度分

8、別為6.0和39℃，為酸性幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶的Km值為1.7118mg/mL。金屬離子對幾丁質(zhì)酶活性影響較大，其中Fe2+和Cu2+對幾丁質(zhì)酶影響最為顯著。
　　對白僵菌CXJ-1幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與大腸桿菌（Escherichiacoli）克隆載體pMd18-T連接，獲得含有球孢白僵菌CXJ-1幾丁質(zhì)酶基因的重組質(zhì)粒并測序。對測序結(jié)果表明：該基因序列大小為1150bp，基因序列與球孢白僵菌（AY145440）、球孢白僵