應(yīng)用RNAi技術(shù)對(duì)球孢白僵菌羧基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BbJEN1的初步研究.pdf

1、羧基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是近年來(lái)分離出的新基因，在蟲(chóng)生真菌中，它既與穿透昆蟲(chóng)體壁所需的能量有關(guān)，也受昆蟲(chóng)體壁的誘導(dǎo)，因此推測(cè)是一種重要的毒力因子，但確切功能尚需確定。本研究運(yùn)用RNA干擾的方法，通過(guò)將球孢白僵菌羧基轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BbJEN1沉默來(lái)初步研究其功能。
　　 實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了兩種干擾載體：①PRNAi：根據(jù)基因庫(kù)上的BbJEN1mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成兩端含有酶切位點(diǎn)的64個(gè)堿基的寡核苷酸鏈。寡核苷酸鏈退火后用T4DNA連接酶連接到線

2、性化的pRNA-U6.1-Hygro質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR及測(cè)序鑒定。②pbarGPE1-RNAi：根據(jù)GenBank中的BbJEN1基因組DNA序列設(shè)計(jì)兩對(duì)分別含有特定酶切位點(diǎn)的特異引物，以球孢白僵菌基因組DNA為模板擴(kuò)增目的基因片段。將正反向目的片段插入pbarGPE1質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定。
　　 干擾載體構(gòu)建成功后，通過(guò)對(duì)分生孢子的抑制性實(shí)驗(yàn)，篩選出潮霉素B

3、對(duì)球孢白僵菌的最佳抑制濃度為600μg/mL。采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和芽生孢子轉(zhuǎn)化兩種方法轉(zhuǎn)化球孢白僵菌，均獲得轉(zhuǎn)化子。其中芽生孢子轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)化子為7個(gè)/μgDNA，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)化子為0.9個(gè)/μgDNA。RT-PCR結(jié)果顯示：構(gòu)建的干擾載體抑制了BbJEN1的表達(dá)。其中有三個(gè)干擾載體獲得了較好的沉默效果，抑制率分別達(dá)到了71％、75％和82％。
　　 接著對(duì)轉(zhuǎn)化子和原始菌株進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)以及抗逆性等生

4、物學(xué)特征進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化子與原始菌株間生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量差異不顯著，表明BbJEN1基因與菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢無(wú)關(guān)。二者孢子萌發(fā)率無(wú)顯著差異，但轉(zhuǎn)化子孢子萌發(fā)時(shí)間卻明顯滯后：原始菌株的孢子萌發(fā)中時(shí)為14.24±0.58h，而導(dǎo)入PRNAi-1、PRNAi-2、PRNAi-3和pbarGPE1-RNAi的菌株分別為14.45±0.79h、16.22±1.02h、16.13±1.66和16.00±0.41h。經(jīng)抗逆性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，各轉(zhuǎn)化子的活

5、孢率均低于野生菌株，其中導(dǎo)入PRNAi-2，PRNAi-3和pbarGPE1-RNAi致使BbJEN1基因沉默的菌株活孢率顯著低于野生菌株差，而導(dǎo)入PRNAi-1的菌株與野生菌株差異不顯著。這說(shuō)明BbJEN1基因與抗逆性有關(guān)。
　　 對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)（Dendrolimus punctatus）進(jìn)行生物測(cè)定的結(jié)果顯示：對(duì)于原始菌株Bb13，最低劑量引起的累計(jì)校正死亡率為14.68±5.25％，最高劑量的累計(jì)校正死亡率為87.07±7

6、.67％。而基因沉默菌株Bb13-S的最低劑量累計(jì)校正死亡率為6.92±4.98％，最高劑量的累計(jì)校正死亡率為71.56±4.96％，分別低于原始菌株。野生型菌株Bb13兩個(gè)濃度2.5×107和1.25×108的致死中時(shí)分別為6.49±0.39天和5.57±0.28天，Bb13-S兩個(gè)濃度2.5×107和1.25×108的致死中時(shí)分別為8.09±0.41天和7.17±0.36天，均較野生菌株長(zhǎng)1.60天，殺蟲(chóng)速度平均降低26.65％。B

7、b13的致死中濃度和致死中量分別為2.79×106±0.21×106conidia mL-1和84.12±4.11 conidia mm-2，而B(niǎo)b13-S的致死中濃度和致死中量分別提高為1.27×107±0.19×107 conidia mL-1和382.92±24．32 conidia mm-2，相對(duì)野生型菌株平均增加了3.6倍的孢子用量。從致死中時(shí)、累計(jì)死亡率、致死中濃度和致死中量看，改造后的菌株Bb13-s的毒力較野生型菌株有明