西瓜枯萎病拮抗菌的篩選、生物學(xué)特性及發(fā)酵條件和抗生物質(zhì)的研究.pdf

1、由于同一作物、同一地塊長(zhǎng)期連作，產(chǎn)生產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、病害加重等現(xiàn)象稱之為連作障礙。引起連作障礙的主要原因是連作土壤中微生物多樣性下降，細(xì)菌及放細(xì)菌數(shù)量減少，土傳真菌病原菌大量繁殖。西瓜枯萎病是目前西瓜生產(chǎn)中最重要的土傳病害，影響最大，防治最困難。因此，研究西瓜枯萎病的防治對(duì)西瓜生產(chǎn)具有重大的意義。利用有益微生物或拮抗微生物對(duì)西瓜枯萎病進(jìn)行生物防治，抑制西瓜尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)繁殖，控制西瓜枯萎病的發(fā)生，是一種很有前景的生物防治方法。

2、r>　　 通過系列稀釋涂布平板、對(duì)峙培養(yǎng)等方法，從長(zhǎng)期連作的健康西瓜的根際土壤中分離篩選得到兩株西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌菌株N8和H11，通過形態(tài)特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列相似性分析，將其初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　 菌株N8和H11在pH值5.0-7.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好。菌株N8最適生長(zhǎng)pH為5.0，搖瓶培養(yǎng)21h時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期;菌株H11最適生長(zhǎng)pH為6.0，搖瓶培養(yǎng)18h時(shí)

3、到達(dá)穩(wěn)定期。菌株N8和H11的最適生長(zhǎng)溫度均為35℃，最佳裝液量為75 mL/250 mL，最佳接種量為5％。菌株N8和H11對(duì)氨芐青霉素均有抗性;對(duì)常見的化學(xué)農(nóng)藥具有廣泛的耐受性。
　　 拮抗菌株N8產(chǎn)生的抗菌活性在pH為5.5時(shí)最強(qiáng)，H11產(chǎn)生的抗菌活性在pH為5-5.5時(shí)最強(qiáng)。溫度對(duì)N8和H11產(chǎn)生的抗菌活性影響都不大，在3＜pH＜9的范圍內(nèi)抗菌活性均比較穩(wěn)定，但強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中抗菌活性都明顯下降，即在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中抗菌活性

4、不穩(wěn)定。拮抗菌株N8和H11及其發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani Kuhn)、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici Leonian）、辣椒黑點(diǎn)炭疽病菌（Vermicularia copsici）、玉米小斑病菌[Bipolaris maydis(Nishik.& Miyabe)shoem.]、黃瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）及稻瘟病菌[Magnaporthe grise

5、a(Hebert)Barr]均具有較強(qiáng)的拮抗能力，抑菌圈均在25 mm以上，說明兩菌株均具有廣譜性，在生物防治方面有一定的應(yīng)用潛力。
　　 經(jīng)過液體發(fā)酵培養(yǎng)，以一定量的除菌發(fā)酵濾液對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制率作為判定抗菌活性的主要指標(biāo)，篩選出培養(yǎng)基B為菌株N8和H11產(chǎn)抗生物質(zhì)最適的初始培養(yǎng)基;對(duì)培養(yǎng)基B各成分及無(wú)機(jī)鹽組成進(jìn)行優(yōu)化，確定正交優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為:馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，硫酸銨3 g，磷酸二氫鉀2

6、g，水1000 mL。采用不同的培養(yǎng)溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間及不同的通氣量對(duì)菌株N8和H11進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，確定菌株N8產(chǎn)生抗生物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件為:初始pH為6，接種量為5％，裝液量為50 mL/250 mL，發(fā)酵周期為48 h，溫度為30℃時(shí)，抗菌活性達(dá)到最大值，抑菌率為78.43％; H11產(chǎn)生抗生物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件為:初始pH為6，接種量為5％，裝液量為50 mL/250 mL，發(fā)酵周期為72 h，溫度為3

7、0℃時(shí)，抗菌活性達(dá)到最大值，抑菌率為72.55％。
　　 拮抗菌株N8所產(chǎn)生的抗生物質(zhì)屬于胞外分泌型，可以溶解于乙醇等有機(jī)溶劑中，通過調(diào)節(jié)pH值、有機(jī)溶媒沉淀、硅膠薄層層析可以分離純化得到抗生物質(zhì)。
　　 盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，拮抗菌株N8和H11及另外一株拮抗放線菌對(duì)西瓜枯萎病具有明顯的防治作用，防治率分別為76.46％、57.65％和61.09％;拮抗菌株配合施用有機(jī)肥與其單獨(dú)施用相比，防治效果明顯提高，防治率在單獨(dú)施用的基