大黃素和維生素C對團頭魴生長、非特異性免疫以及抗應激的影響.pdf

1、大黃素(Emodin)是從中草藥大黃(Rheum officinale Baill)根莖中提取的主要有效成分，具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及清除氧自由基、降血脂、保護肝臟和免疫調節(jié)等多種功效。維生素C(Ve)是魚類必需的營養(yǎng)素，兼有免疫增強和抗氧化的雙重功效，但大多數魚類缺乏合成Ve所需的L古洛糖酸內酯氧化酶(L-gulonolaetone oxidase，GLO)，必須從食物中攝取Vc．為了研究大黃素和高劑量Ve對魚類生長、非特異性

2、免疫以及抗應激的影響，選用我國主要淡水養(yǎng)殖魚類之一的團頭魴(Megalobramaamblycephala，Yih)作為研究對象，首先分離、克隆出團頭魴兩種熱休克蛋白70 eDNA的全長序列，并對其基因結構和表達特征進行了分析．然后，在此基礎上構建了團頭魴兩種HSP70s的原核表達系統(tǒng)，并優(yōu)化了表達條件，對表達產物進行了純化和鑒定．同時，選取1200尾健康的團頭魴，體質量(133.44+2.11)g，隨機分成4組，其中1組為對照組，投喂

3、基礎日糧(Ve含量50.3 mg/kg)，另外3組為試驗組，投喂飼料是在基礎日糧中分別添加60 mg/kg大黃素、700 mg/kg Ve、60 mg/kg大黃素+700 mg/kg Ve，每組設3個重復．連續(xù)投喂60 d后結束飼養(yǎng)試驗，取魚進行擁擠脅迫、高溫應激和感染嗜水氣單胞茵的應激試驗．1團頭魴兩種熱休克蛋白70基因克隆與序列分析
　　 采用RT-PCR和eDNA末端快速擴增法(rapid amplification of

4、 eDNA ends，RACE)，分別從室溫和34℃熱激團頭魴的肝臟中克隆到兩種熱休克蛋白70基因，分別命名為Ma-HSC70和Ma-HSP70基因．它們的eDNA全長分別為2336和2224 bp[不包括poly(A)]，分別含有1950和1932 bp的開放閱讀框，編碼649和643個氨基酸，分子量約為71.24和70.52kD，理論等電點為5.25和5.30．Ma-HSC70基因在編碼區(qū)含有7段內含子，所有內含子均遵守GT/AG法

5、則，為組成型HSC70，而Ma-HSP70基因在編碼區(qū)不含內含子，為誘導型HSP70．氨基酸序列分析表明，Ma-HSC70和Ma-HSP70均含有HSP70家族的3個簽名序列，兩個部分重疊的雙向核定位信號序列(nuclearlocalization signal sequence，NLS)以及胞質的特征基序EEVD等。同源性分析表明，Ma-HSC70與異育銀鯽等脊椎動物HSC70的氨基酸序列相似性高達93.0％以上，而Ma-HSP70與

6、鯽魚等脊椎動物HSP70氨基酸序列的相似性高達85.0%以上，它們之間氨基酸序列相似性為86.5%。生物信息學分析顯示，團頭魴兩種HSP70s基因所編碼的蛋白以親水性區(qū)域為主，均具有豐富的B細胞抗原位點，無信號肽，為非典型的分泌型蛋白，無明顯的跨膜區(qū)域；同時還含有眾多的蛋白激酶C磷酸化位點、N-肉豆蔻酰化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點和N-糖基化位點，推測這些位點在蛋白質折疊，轉運，細胞內定位以及細胞信號轉導與調控中發(fā)揮重要作用。這兩種

7、蛋白的二級結構均以a-螺旋和無規(guī)卷曲為主，空間結構包括N端ATPase功能域和C端多肽結合功能域。2大黃素和維生素C對團頭魴生長、生理生化指標以及兩種HSP70smRNA表達的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結束后，測定團頭魴的生長性能，并采樣檢測魚的肌肉成分、血液和肝臟生化指標以及肝臟兩種HSP70s mRNA的表達水平。結果表明，與對照組相比，大黃素、Vc組顯著提高了魚體增重率和特定生長率，血清中總蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和堿性磷

8、酸酶(AKP)的水平，肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和誘導型HSP70mRNA的基礎表達水平，降低了餌料系數、死亡率、血清中皮質醇(COR)、甘油三酯(TG)以及肝臟丙二醛( MDA)的含量(P<0.05)；配伍組雖然血清中TP、LSZ的含量以及肝臟HSP70 mRNA的水平顯著升高，肝臟MDA的含量也顯著降低(P<0.05)，但均未表現出協同增效作用．此外，與對照組相比，大黃素組還顯著提高了團頭魴肝臟過氧化氫酶( CAT)的活性

9、（P<0.05），而Vc和配伍組CAT的活性與對照組的差異不顯著（P>0.05）；其它一些指標如血清中葡萄糖(GLU)、谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶( GOT)、膽固醇(CHOL)，肝臟組成型HSC70 mRNA的表達水平，魚體形體指標以及肌肉組成成分等各組之間差異均不顯著（P>0.05）．3大黃素和維生素C對團頭魴在擁擠脅迫下的生化指標及兩種HSP70smRNA表達的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結束后，從各池中取25尾規(guī)格基本一致

10、的團頭魴，進行連續(xù)48 h的擁擠脅迫(100g/L)試驗，分別于Oh、12h、24 h、48 h取樣分析團頭魴血液和肝臟的生化指標以及肝臟兩種HSP70s mRNA的表達水平，并統(tǒng)計各組魚的累積死亡率。結果表明，在擁擠脅迫后，與對照組相比，大黃素、Vc組不同程度地提高了團頭魴血清中TP和AKP的水平，肝臟中SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表達水平，降低了血清中COR、GLU，GPT、GOT、TG以及肝臟MDA

11、的水平，而LSZ的活性表現為先下降后升高；配伍組中，這些指標雖然有類似以上的變化趨勢，但大多差異不顯著（P>0.05），且同樣未表現出協同增效作用。此外，各組魚血清CHOL的水平在擁擠脅迫前后的差異均不顯著(p>0.05）。統(tǒng)計表明，大黃素和Vc組魚的累積死亡率在擁擠脅迫24 h、48 h均顯著低于對照組（P<0.05），而配伍組與對照組的差異均不顯著（P>0.05）．4大黃素和維生素C對團頭魴在高溫應激下的生化指標及兩種HSP70sm

12、RNA表達的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結束后，從各池中取25尾規(guī)格基本一致的魚進行高溫應激(34℃)試驗。取樣檢測團頭魴在高溫應激前后血液和肝臟的生化指標以及肝臟兩種HSP70smRNA的表達水平，并統(tǒng)計各組魚在高溫應激下的累積死亡率，結果表明，在高溫應激后，與對照組相比，大黃素、Vc組不同程度地提高了團頭魴血清TP、LSZ和AKP的水平，肝臟SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70mRNAs的表達水平，降低了血清COR、GLU

13、、GPT、GOT、TG以及肝臟MDA的水平；配伍組中，這些指標雖然也有類似以上的變化趨勢，但大多差異不顯著（P>0.05），且未表現出協同增效作用。此外，各組魚血清膽固醇的含量在高溫應激前后的差異均不顯著(P>0.05）。統(tǒng)計表明，在高溫應激下，Vc組魚的累積死亡率均顯著低于對照組，大黃素組魚的累積死亡率除6h外，也顯著低于對照組（P<0.05），而配伍組與對照組的差異均不顯著（P>0.05）．5大黃素和維生素C對團頭魴感染嗜水氣單胞菌

14、后的生化指標及兩種HSP70s mRNA表達的影響
　　 飼養(yǎng)試驗結束后，從各池中取15尾團頭魴進行腹腔注射感染嗜水氣單胞菌試驗，并在攻毒前后采樣檢測團頭魴血液和肝臟的生化指標以及肝臟兩種HSP70s mRNA的表達水平；另從各池中取10尾魚進行同樣的攻毒試驗，并統(tǒng)計攻毒后魚的累積死亡率．結果表明，經攻毒后，與對照組相比，大黃素、Vc組不同程度地提高了團頭魴血清TP、LSZ和AKP的水平，肝臟SOD和CAT的活性以及HSC70和

15、HSP70 mRNAs的表達水平，降低了血清COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝臟MDA的水平；配伍組中，這些指標雖然有類似上述的變化趨勢，但大多與對照組的差異不顯著(P>0.05)，且未表現出協同增效作用。此外，各組魚血清膽固醇的含量在攻毒前后的差異均不顯著(P>0.05）。統(tǒng)計也表明，經攻毒后，大黃素和Vc組魚的累積死亡率在24 h、48 h均顯著低于對照組(P<0.05)，而配伍組魚的累積死亡率與對照組的差異均不顯著(P>0

16、.05)．6團頭魴兩種熱休克蛋白70的原核表達、純化及鑒定
　　 采用PCR方法擴增團頭魴組成型HSC70和誘導型HSP70基因完整的編碼區(qū)片段，并分別克隆到原核表達載體pET-22b(+)中，經雙酶切和DNA測序鑒定后，將這兩種重組表達質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)，用lmmol/L IPTG在不同溫度及時間下進行誘導表達，并對表達產物進行SDS-PAGE分析，建立最佳誘導表達條件．采用Ni-NTA His Bind

17、Resins親和層析和DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析對目的蛋白進行純化，并進行Western-blotting驗證。結果表明，成功構建了團頭魴兩種重組表達質粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70，表達融合蛋白的相對分子量均約為72 kD，并能與兔抗人HSP70多抗進行特異性結合，這兩種HSP70s融合蛋白經純化后的純度均達到95%以上，在較高溫度(37℃)下，有利于融合蛋白的

18、快速大量表達，但易形成包涵體；在較低溫度(25℃)下，有利于融合蛋白的可溶性表達，但也會降低融合蛋白的表達速度。綜合各種因素，本實驗選擇融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分別誘導7h作為可溶性表達的最佳條件．
　　 總之，本研究首次從團頭魴肝臟中克隆到兩種HSP70s基因，并對該基因的結構和表達特征進行了分析，確定Ma-HSC70基因為組成型，而Ma-HSP70基因為誘導型。在此基礎上成功構建了團頭魴兩