球孢白僵菌兩種甘露醇脫氫酶及五種過(guò)氧化氫酶的功能分析與對(duì)鱗翅目幼蟲(chóng)高口服毒力的工程菌株構(gòu)建.pdf

1、球孢白僵菌已被開(kāi)發(fā)成多種制劑應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)的防治，但其田間防治效果受環(huán)境因子的制約，這是制約真菌殺蟲(chóng)劑大規(guī)模應(yīng)用推廣的技術(shù)瓶頸和亟待解決的國(guó)際難題。開(kāi)展白僵菌抗逆生物學(xué)研究，揭示抗逆性狀的分子基礎(chǔ)，定向遺傳改良生產(chǎn)菌株的抗逆力和毒力，是提升生防真菌制劑質(zhì)量和田間應(yīng)用穩(wěn)定性的核心技術(shù)途徑。
　　 甘露醇是生物體內(nèi)廣泛存在的小分子多元醇，作為碳源儲(chǔ)備物，也參與真菌的抗逆境脅迫生理反應(yīng)。過(guò)氧化氫酶是細(xì)胞抗氧化酶系的重要成員，在細(xì)胞抵抗

2、活性氧自由基(ROS)脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前在生防真菌中有關(guān)甘露醇代謝相關(guān)酶系的生物學(xué)功能知之有限，對(duì)過(guò)氧化氫酶在抗逆反應(yīng)中的作用也鮮有研究報(bào)道。另外，將外源蘇云金芽孢桿菌(簡(jiǎn)稱Bt)營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白Vip3Aa1基因置于構(gòu)巢曲霉組成型通用啟動(dòng)子Pgpd4下導(dǎo)入球孢白僵菌中能有效提高工程菌株對(duì)斜紋夜蛾低齡幼蟲(chóng)的毒力，但受啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)力的影響，Vip3Aa1毒蛋白的表達(dá)量不足以致死高齡的葉面暴食性害蟲(chóng)。為此，本論文從揭示球孢白僵菌抗

3、逆生物學(xué)機(jī)理及提高菌株口服毒力的角度出發(fā)，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源重組以及芽生孢子化學(xué)轉(zhuǎn)化法，系統(tǒng)研究了球孢白僵菌中甘露醇代謝相關(guān)酶和過(guò)氧化氫酶的基因家族的時(shí)空表達(dá)情況以及各基因缺失對(duì)菌株抗逆力和毒力的影響；以球孢白僵菌自身疏水蛋白基因啟動(dòng)子的克隆及優(yōu)化為切入點(diǎn)，構(gòu)建了高表達(dá)Vip3Aa1蛋白的球孢白僵菌工程菌株，并評(píng)價(jià)了其對(duì)斜紋夜蛾各齡幼蟲(chóng)雙途徑感染的殺蟲(chóng)活性。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 甘露醇1-磷酸脫氫酶(MPD)的基因克

4、隆、表達(dá)純化及酶學(xué)特征分析通過(guò)序列比對(duì)及簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增，從球孢白僵菌Bb2860基因組中克隆到甘露醇1-磷酸脫氫酶基因BbMPD，序列全長(zhǎng)1334 bp，其開(kāi)放閱讀框(ORE)長(zhǎng)1176 bp，含一個(gè)158 bp的內(nèi)含子，編碼一條由391個(gè)氨基酸組成的典型的真菌甘露醇1-磷酸脫氫酶，預(yù)測(cè)分子量為42.8 kDa，與已知的其它17種真菌MPD蛋白的序列同源性為56～74％，且在N端含有一個(gè)NADH輔因子結(jié)合域(GAGRIG)。在大腸桿菌中成

5、功表達(dá)了BbMPD的重組蛋白，其純化產(chǎn)物的最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH7.0，對(duì)果糖6-磷酸具有底物專一性，米氏常數(shù)Km和Vmax分別為0.89±0.05 mM和913.5±14.9 U/mg蛋白，還原D-果糖6-磷酸的催化效率(Kcat/Km)為1.31×104 mM-1 S-1。
　　 甘露醇脫氫酶(MTD)的基因克隆及兩個(gè)脫氫酶基因的表達(dá)調(diào)控首次從Bb2860基因組中克隆到甘露醇脫氫酶基因BbMTD，其上游序列有3個(gè)

6、脅迫響應(yīng)元件(AGGGG)和5個(gè)碳利用阻遏元件CREA(SYGGRG)附著位點(diǎn)的保守序列；ORF全長(zhǎng)801bp，編碼266個(gè)氨基酸，蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為28.2 kDa和6.6，與其它真菌MTD的同源性較高，N端第28個(gè)氨基酸處存在一個(gè)NADPH輔因子結(jié)合域(GPKGIG)。
　　 BbMTD在菌絲生長(zhǎng)的前五天轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平逐步遞增，第五天的表達(dá)量約為第二天的20倍，但在此后的兩天里又有所下降。BbMPD的轉(zhuǎn)錄水平在連續(xù)七天培

7、養(yǎng)過(guò)程中保持相對(duì)恒定，第4天表達(dá)水平最高。在1 M NaCl的滲透壓脅迫和50 mM H2O2的氧化脅迫下，基因表達(dá)均呈現(xiàn)隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而顯著上調(diào)的趨勢(shì)，滲透壓脅迫3h后的BbMTD和BbMPD基因表達(dá)水平分別較空白對(duì)照提高了5.0和10.9倍；相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平在氧化脅迫3h后分別上調(diào)了11.4和74.9倍。兩基因在熱脅迫條件下的表達(dá)水平均受抑制，熱激3h后，BbMPD的表達(dá)水平為正常條件下的63％，而B(niǎo)bMTD只有一半左右。結(jié)果表明

8、，兩基因均參與球孢白僵菌抵抗逆境脅迫的防御反應(yīng)。
　　 BbMPD和BbMTD基因的敲除及突變株表型分析應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功構(gòu)建BbMPD和BbMTD基因的缺失突變株ABbMPD和ABbMTD。酶活分析顯示，BbMPD和BbMTD均是球孢白僵菌甘露醇代謝的關(guān)鍵催化酶，△BbMPD菌株粗酶液無(wú)法還原果糖6-磷酸，而△BbMTD有低水平的酶活殘留。無(wú)論是在固體SDAY平板正常條件下生長(zhǎng)，還是在液體SDB脅迫條件下培養(yǎng)

9、，單基因敲除株胞內(nèi)甘露醇含量均顯著低于野生株。在正常生長(zhǎng)條件下，△BbMPD和△BbMTD菌絲(或分生孢子)中甘露醇的含量分別減少了68％(83％)和16％(38％)。滲透壓能誘導(dǎo)菌株胞內(nèi)甘露醇的合成，1 M NaCl刺激24 h后，△BbMPD和△BbMTD菌絲甘露醇含量分別提高3.0和1.7倍。而熱激培養(yǎng)則抑制其合成，35℃下培養(yǎng)一天，相應(yīng)的甘露醇合成水平只有正常培養(yǎng)條件下的40.7％和62.3％。有趣的是，各菌株胞內(nèi)甘露醇合成的減

10、少伴隨著海藻糖含量的上升。例如，正常平板培養(yǎng)條件下，△BbMPD菌絲和分生孢子中海藻糖的含量較野生株分別提高1.7倍和1.5倍。
　　 除胞內(nèi)可溶性甘露醇和海藻糖含量變化外，BbMPD基因的敲除顯著影響菌株的產(chǎn)孢能力(下降27％)，而△BbMTD菌株的產(chǎn)孢則不受影響。兩敲除株菌絲和孢子在不同的單一碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)表型差異明顯。△BbMPD菌絲生長(zhǎng)速度不受影響，但分生孢子的萌發(fā)速率較野生株顯著降低，在以果糖，葡萄糖和甘露醇為單一

11、碳源平板上孢子萌發(fā)50％所需的時(shí)間(GT50)分別延遲3.0、3.1和6.6h；△BbMTD菌絲生長(zhǎng)則受到顯著抑制，但其分生孢子除在甘露醇平板上萌發(fā)延遲之外(GT50后延7.1 h)，萌發(fā)速率在其他碳源平板上差異不顯著?？鼓媪y(cè)定顯示，甘露醇合成受阻能致球孢白僵菌的分生孢子對(duì)活性氧、高溫、紫外等環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力顯著下降。△BbMPD和△BbMTD分生孢子對(duì)H2O2的耐受力分別較野生株下降38％和18％，對(duì)UV-B輻射的耐受力(LD50

12、：0.26和0.36 J/cm2)比野生株(LD50:0.42 J/cm2)分別下降39％和16％，對(duì)45℃熱脅迫的耐受力(LT50:39.0 min和46.1 min)比野生株(52.0 min)分別下降22％和11％。然而，上述基因的缺失不顯著影響菌株對(duì)桃蚜的毒力以及對(duì)高滲透壓脅迫的耐受力。
　　 球孢白僵菌過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)基因家族的克隆、序列分析及表達(dá)調(diào)控通過(guò)保守序列比對(duì)從球孢白僵菌2860基因組中克

13、隆到五個(gè)CAT基因，分別編碼三種單功能CAT(BbcatA、BbcatB和BbcatC)和兩種雙功能CAT(BbcatP和BbcatD)。其中，BbcatC為小亞基酶，蛋白序列中含有NADPH綁定域，其余四種均為大亞基酶。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析表明，五種CAT分別屬于不同的蛋白家族。其中，BbcatA屬于cladeA(孢子特異性CAT)，主要參與分生孢子的形成及發(fā)育過(guò)程，其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在產(chǎn)孢過(guò)程中逐漸累積，而在孢子萌發(fā)和菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)過(guò)程

14、中大幅降低；氧化脅迫能提高該基因轉(zhuǎn)錄水平，50 mM H2O2脅迫3 h的表達(dá)水平為空白對(duì)照的4.5倍。BbcatB和BbcatD屬于clade B(分泌性CAT)，在蛋白N端均含有一段19個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽。BbcatB基因的表達(dá)水平隨菌落生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上調(diào)，第7天的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到第二天的30.2倍。BbcatD基因的表達(dá)在生長(zhǎng)的前5天內(nèi)保持較低的水平，而在第6天和第7天顯著增強(qiáng)，分別達(dá)到第二天的53.1和158.3倍。氧化脅迫均

15、能誘導(dǎo)BbcatB和BbcatD基因的表達(dá)，分別提高8.6和6.9倍。BbcatC和BbcatP均屬于clade P(過(guò)氧化物酶體CAT)，它們分別在蛋白中間段和C端含有PTS信號(hào)序列。BbcatC基因在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸上升，而B(niǎo)bcatP基因在7天的菌落生長(zhǎng)過(guò)程中其表達(dá)水平相對(duì)平穩(wěn)。與其他四種CAT基因的表達(dá)水平相比，BbcatP基因受H2O2脅迫的影響最為顯著，3 h脅迫處理后，其轉(zhuǎn)錄水平較正常條件提高13.5倍。結(jié)果

16、表明，各CAT在球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演不同的角色，且不同程度地參與氧化脅迫的防御反應(yīng)。
　　 球孢白僵菌五種過(guò)氧化氫酶的生物學(xué)功能分析應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功構(gòu)建球孢白僵菌各CAT基因的單敲除株。酶活測(cè)定顯示，正常生長(zhǎng)條件下，菌絲CAT活力主要取決于BbcatB、BbcatP和BbcatD?；钚匀旧玃AGE凝膠上僅呈現(xiàn)BbcatB(高)和BbcatP(低)兩條酶帶，氧化脅迫及熱激等脅迫條件并不能改變相應(yīng)的酶譜類

17、型?？鼓媪y(cè)定表明，△BbcatC和△BbcatP菌絲對(duì)氧化脅迫十分敏感，50 mM H2O2幾乎完全抑制△BbcatP菌落的生長(zhǎng)，而其它三種CAT的缺失突變株的菌落生長(zhǎng)沒(méi)有受到明顯抑制。△BbcatB菌落生長(zhǎng)在含4 mM甲萘醌的培養(yǎng)基上明顯受抑制，其他CAT基因缺失株生長(zhǎng)則差異不顯著。在滲透壓(NaCl)、殺菌劑(多菌靈)以及熱脅迫(33℃)條件下，各敲除株的菌落生長(zhǎng)表型均未受到顯著影響。另一方面，CAT基因敲除后可顯著影響分生孢子對(duì)

18、H2O2、UV-B和高溫的耐受力，但影響程度不同。△BbcatA、△BbcatP和△BbcatC分生孢子對(duì)H2O2的耐受力分別較野生株下降42.6％、57.0％和34.5％，而△BbcatB和△BbcatD的分生孢子對(duì)此氧化脅迫的耐受力未受顯著影響。各敲除株的孢子對(duì)UV-B輻射的耐受力也表現(xiàn)不同程度的下降，以△BbcatB和△BbcatD最為顯著，較野生株分別下降52.4％和47.6％。耐熱力測(cè)定顯示，△BbcatA分生孢子在45℃熱脅

19、迫下的半致死時(shí)間LT50較野生株下降40％，但其余敲除株都與野生株的LT50均為52.0 min。
　　 毒力測(cè)定顯示，敲除株△BbcatA、△BbcatP和△BbcatD對(duì)斜紋夜蛾二齡幼蟲(chóng)的毒力顯著低于野生株，其LT50分別較野生株下降1.4天、1.8天和0.9天，而另兩個(gè)敲除株與野生株無(wú)異，其LT50為5.0～5.1天之間。由此可見(jiàn)，CAT是球孢白僵菌克服昆蟲(chóng)寄主ROS相關(guān)的抗氧化酶系，因而是影響菌株重要抗逆性狀和毒力的重要

20、因子。
　　 球孢白僵菌內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子Phyd1的克隆與優(yōu)化為了尋找一種可在球孢白僵菌中高表達(dá)外源有益基因的內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子，從Bb2860基因組中克隆到Ⅰ型疏水蛋白基因(hyd1)的上游序列，并分別截成-1798(全長(zhǎng)、-1290、-1179、-991和-791 bp)不同長(zhǎng)度的片段或?qū)?1290片段特定轉(zhuǎn)錄因子(StuA、NIT2和Mat-Mc)結(jié)合位點(diǎn)施以定點(diǎn)突變后，與綠色熒光蛋白報(bào)告基因eGFP融合起來(lái)，在球孢白僵菌Bb286

21、0中轉(zhuǎn)化表達(dá)，考察各轉(zhuǎn)化子中eGFP蛋白相對(duì)于外源通用啟動(dòng)子PgpdA調(diào)控的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，攜帶3個(gè)必要轉(zhuǎn)錄因子的-1290 bp為最優(yōu)的啟動(dòng)子片段(Phyd1-t1)，由其驅(qū)動(dòng)eGFP表達(dá)的轉(zhuǎn)化子菌落的相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFI)是PgpdA驅(qū)動(dòng)的15.6倍，且eGFP蛋白主要積累于分生孢子形成階段，尤以成熟的分生孢子中表達(dá)量最高。其他截頭片段或定點(diǎn)突變的啟動(dòng)子片段啟動(dòng)基因表達(dá)的效率均不如Phyd1-t1，而-791 bp片段幾乎完全失

22、去啟動(dòng)外源基因表達(dá)的能力。在定點(diǎn)突變的片段中，以StuA結(jié)合位點(diǎn)的突變影響eGFP基因表達(dá)最甚。
　　 高表達(dá)中腸特異性殺蟲(chóng)蛋白Vip3Aa1的球孢白僵菌工程株的構(gòu)建及毒力分析將外源Bt營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白基因Vip3Aa1置于優(yōu)化的內(nèi)源啟動(dòng)子Phyd1-t1下導(dǎo)入野生株Bb2860中，篩選鑒定出一株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢性狀良好且遺傳穩(wěn)定的工程株BbHV8。實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA分析顯示，與BbV28菌株(本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建由PgpdA啟動(dòng)V

23、p3Aa1表達(dá)的工程菌株)相比，BbHV8培養(yǎng)4天的菌落(菌絲)中Vip3Aa1基因的轉(zhuǎn)錄水平上升112倍，在菌絲和培養(yǎng)7天形成的分生孢子中Vip3Aa1蛋白的表達(dá)量分別提高7.8和9.8倍。Western雜交和免疫膠體金定位分析表明，Vip3Aa1蛋白在BbHV8分生孢子中高表達(dá)且均與分布于細(xì)胞質(zhì)中。孢子被四齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)攝食24 h后，能在中腸液中通過(guò)Western雜交檢測(cè)到一條62 kDa的活性條帶。生測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，BbHV8菌株對(duì)

24、斜紋夜蛾二至五齡幼蟲(chóng)均表現(xiàn)出明顯的Vip3Aa1特有的口服感染毒力，致死蟲(chóng)尸嚴(yán)重萎縮，保濕培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌絲稀薄甚至不長(zhǎng)。時(shí)間-劑量-死亡率(TCM)觀察顯示，BbHV8的殺蟲(chóng)速度明顯快于BbV28和Bb2860，高濃度處理下，BbHV8在處理后第三天能分別殺死100％和53％的二、三齡幼蟲(chóng)，而B(niǎo)bV28和Bb2860在第8天才殺三齡幼蟲(chóng)62％和45％。
　　 TCM模擬分析顯示，Bb2860、BbV28和BbHV8對(duì)斜紋夜蛾二齡

25、幼蟲(chóng)的LC50隨接種天數(shù)差異顯著。BbHV8對(duì)斜紋夜蛾二齡幼蟲(chóng)的LC50及其95％置信限由第2天的1293(889～1880)孢子/mm2下將至第5天的26(16～44)孢子/mm2。Bb2860和BbV28對(duì)三齡幼蟲(chóng)LC50的差異不顯著，但均顯著高于BbHV8的LC50?；诟骶甑腖C50值，BbHV8處理后3～8天期間對(duì)二、三齡幼蟲(chóng)的毒力分別為BbV28的8～80倍和Bb2860的18～931倍，毒力差異倍數(shù)隨處理后時(shí)間延長(zhǎng)而縮小

26、。在可比較的處理劑量下，BbHV8對(duì)二、三齡幼蟲(chóng)的LT50比BbV28和Bb2860分別縮短1.5～3.8天和2.9～4.6天，即在給定劑量下，BbHV8的殺蟲(chóng)速度比BbV28快63～100％，比Bb2860快1.1～1.6倍。此外，BbHV8在處理后3～8天殺死90％二至五齡幼蟲(chóng)的孢子劑量為678～1389個(gè)孢子/mm2，BbV28和Bb2860對(duì)三齡幼蟲(chóng)無(wú)可計(jì)算的LC50。以上結(jié)果表明，Phyd1-t1能強(qiáng)啟動(dòng)外源毒素基因的表達(dá)并大

27、量積累毒蛋白于球孢白僵菌分生孢子中，從而大幅提高其對(duì)高齡暴食性害蟲(chóng)的毒力。
　　 綜上所述，本研究主要成果和創(chuàng)新點(diǎn)在于，一是成功克隆了球孢白僵菌中與甘露醇代謝相關(guān)的BbMPD和BbMTD基因，通過(guò)基因敲除和表型分析首次揭示了它們?cè)谡{(diào)控該菌生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆及毒力性狀中的重要作用。二是首次系統(tǒng)研究了該菌CAT基因種類、結(jié)構(gòu)和功能，闡明了各CAT影響該菌抗逆性狀和毒力的程度。三是發(fā)現(xiàn)了能驅(qū)動(dòng)外源基因在球孢白僵菌分生孢形成階段特異性超表達(dá)