河南部分地區(qū)豬等孢球蟲(chóng)流行情況調(diào)查、致病試驗(yàn)與藥物防治.pdf

1、豬球蟲(chóng)病是豬常見(jiàn)多發(fā)的寄生性原蟲(chóng)病，呈世界性分布，在集約化和散養(yǎng)的豬群中廣泛傳播流行。該病對(duì)于幼齡豬，主要表現(xiàn)為腹瀉、食欲減退和體重下降等臨床癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。成年豬則多為帶蟲(chóng)宿主，不表現(xiàn)臨床癥狀，但多為本病的傳染源。豬球蟲(chóng)病嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，可給養(yǎng)豬造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)報(bào)道，歐美等國(guó)家每年用于該病的預(yù)防和治療費(fèi)用高達(dá)1億美元以上。但由于球蟲(chóng)具有嚴(yán)格的宿主特異性，試驗(yàn)研究只能以豬作為模型動(dòng)物，其自身特點(diǎn)及試驗(yàn)管理的難度相對(duì)

2、較大，加之豬球蟲(chóng)的繁殖率較低和哺乳動(dòng)物球蟲(chóng)人工感染試驗(yàn)研究的不確定性，導(dǎo)致對(duì)豬球蟲(chóng)的研究相對(duì)較少。本論文就豬等孢球蟲(chóng)的生物學(xué)特性以及分子種系發(fā)育關(guān)系等方面進(jìn)行了研究。
　　 1、為了解河南省豬球蟲(chóng)感染情況和蟲(chóng)種分布，于2005年5月至2008年8月，先后應(yīng)用飽和鹽水漂浮法對(duì)河南省商丘、洛陽(yáng)、漯河、鶴壁、鄭州等17個(gè)縣市24個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)和12個(gè)養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)的豬球蟲(chóng)感染和蟲(chóng)種分布情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果在34個(gè)場(chǎng)、戶(hù)中均發(fā)現(xiàn)有球蟲(chóng)感染，

3、豬球蟲(chóng)總場(chǎng)陽(yáng)性率高達(dá)94.44％，豬等孢球蟲(chóng)為83.33％，艾美爾球蟲(chóng)為80.56％；規(guī)?；i場(chǎng)豬等孢球蟲(chóng)場(chǎng)陽(yáng)性率高達(dá)91.67％，顯著高于養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)的場(chǎng)陽(yáng)性率(66.67％)；規(guī)?；i場(chǎng)艾美爾球蟲(chóng)場(chǎng)陽(yáng)性率為79.17％，低于養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)的場(chǎng)陽(yáng)性率(83.33％)。共檢測(cè)糞便樣品2388份，球蟲(chóng)總陽(yáng)性率為13.11％，規(guī)模化豬場(chǎng)與專(zhuān)業(yè)戶(hù)豬的球蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為12.83％和14.00％；豬等孢球蟲(chóng)和艾美爾球蟲(chóng)的總陽(yáng)性率(分別為7.96％和5.

4、15％)無(wú)明顯差異，但規(guī)?；i場(chǎng)的豬等孢球蟲(chóng)陽(yáng)性率(8.90％)顯著高于養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)的豬(4.85％)，而艾美爾球蟲(chóng)的陽(yáng)性率則相反，分別為3.93％和9.16％。不同規(guī)模豬場(chǎng)各年齡段豬球蟲(chóng)感染率存在顯著差異。規(guī)模化豬場(chǎng)不同年齡段豬球蟲(chóng)感染率和不同規(guī)模場(chǎng)豬球蟲(chóng)感染率在20-30日齡之前逐漸升高和其后呈逐漸降低的趨勢(shì)，但在養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)中，11-20d豬的球蟲(chóng)感染率最高，為25.71％，21-30d時(shí)感染率最低，為3.67％，其后的31-40d感

5、染率又突然升高達(dá)18.12％。規(guī)模豬場(chǎng)和養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)的豬等孢球蟲(chóng)感染率、不同規(guī)模豬場(chǎng)的豬等孢球蟲(chóng)平均感染率均以11-20日齡仔豬最高，分別為16.43％，20％和17.13％，且此前感染率逐漸升高和此后感染率顯著降低；190例豬等孢球蟲(chóng)陽(yáng)性豬亦以11-20日齡段感染率最高，其中規(guī)模豬場(chǎng)仔豬為28.83％而在養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)仔豬為51.85％，未見(jiàn)養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)中41日齡以上仔豬感染豬等孢球蟲(chóng)。豬等孢球蟲(chóng)陽(yáng)性的規(guī)?；i場(chǎng)感染率變化在1.25％-50％

6、，專(zhuān)業(yè)戶(hù)豬場(chǎng)感染率變化在1.79％-15.28％。隨著豬年齡的增長(zhǎng)，不同規(guī)模豬場(chǎng)的豬艾美爾球蟲(chóng)平均感染率呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，以41日齡以上的豬感染率最高，為7.48％。養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)的31-40日齡和40日齡以上的豬艾美爾球蟲(chóng)感染率分別為15.22％和12.17％，顯著高于30日齡以下仔豬和規(guī)模豬場(chǎng)各年齡段的豬；規(guī)模豬場(chǎng)以21-30日齡和41日齡以上豬的艾美爾球蟲(chóng)感染率較高，分別為5.50％和5.86％。但不同場(chǎng)豬艾美爾球蟲(chóng)感染率存在顯著差異，最

7、高者達(dá)60％。不同規(guī)模豬場(chǎng)不同年齡段的豬艾美爾球蟲(chóng)感染率存在顯著差異，各規(guī)模豬場(chǎng)各年齡段豬艾美爾球蟲(chóng)感染情況變化在0.84％-19.15％各養(yǎng)豬戶(hù)各年齡段豬艾美爾球蟲(chóng)感染情況變化在2.78％-23.26％。123例艾美爾球蟲(chóng)陽(yáng)性豬亦以規(guī)模豬場(chǎng)41日齡以上豬感染率最高，為44.44％；其次為21-30日齡仔豬，感染率為23.61％。專(zhuān)業(yè)戶(hù)所養(yǎng)的豬以41日齡以上和31-40日齡仔豬感染率最高，分別為45.10％和41.18％。共發(fā)現(xiàn)2屬8種

8、球蟲(chóng)，分別為豬等孢球蟲(chóng)(Isospora suis)、豬艾美爾球蟲(chóng)(Eimeria suis)、豚艾美爾球蟲(chóng)(E.porci)、新蒂氏艾美爾球蟲(chóng)(E.neodebliecki)、蒂氏艾美爾球蟲(chóng)(E.debliecki)、極細(xì)艾美爾球蟲(chóng)(E.perminuta)、粗糙艾美爾球蟲(chóng)(E.seabra)和楊陵艾美爾球蟲(chóng)新種(Eimeriayanglingensis sp.)；球蟲(chóng)OPG值均不大，規(guī)模豬場(chǎng)豬球蟲(chóng)平均OPG值為9313(200-46

9、400)，豬等孢球蟲(chóng)平均OPG值為7827(200-46400)；養(yǎng)豬專(zhuān)業(yè)戶(hù)豬球蟲(chóng)平均OPG值為10818(800-24600)，豬等孢球蟲(chóng)平均OPG值為8300(2400-22600)；各球蟲(chóng)陽(yáng)性豬場(chǎng)各年齡段仔豬均存在4-6種球蟲(chóng)混合感染，其中I.suis見(jiàn)于各年齡段仔豬，屬優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種。
　　 2、為了解豬等孢球蟲(chóng)生物學(xué)特性，采用單卵囊分離技術(shù)分離純種豬等孢球蟲(chóng)卵囊，分別給6頭3日齡仔豬一次經(jīng)口感染30個(gè)孢子化豬等孢球蟲(chóng)卵囊。經(jīng)

10、形態(tài)學(xué)鑒定，傳代卵囊為純種豬等孢球蟲(chóng)卵囊，收集其卵囊進(jìn)行繼代擴(kuò)增，分別經(jīng)口灌服感染6頭3日齡和22頭5日齡無(wú)球蟲(chóng)仔豬，每頭感染2000個(gè)孢子化卵囊，獲得大量純種豬等孢球蟲(chóng)卵囊。結(jié)果表明，卵囊形態(tài)與其排出時(shí)間存在一定關(guān)系，不同溫度對(duì)其卵囊孢子化存在影響；薄壁型和厚壁型卵囊在孢子化過(guò)程中存在較大差異。
　　 3、為了解仔豬感染豬等孢球蟲(chóng)后的排卵囊規(guī)律，分別設(shè)置10個(gè)不同接種劑量感染組(30，0.2×104，1×104，5×104，1

11、5×104，20×104，22×104，30×104，50×104，100×104)，于3日齡一次經(jīng)口感染無(wú)球蟲(chóng)仔豬，每頭接種卵囊液為2mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除感染30個(gè)卵囊劑量組潛隱期為9d外，其他不同劑量組潛隱期4-6d，多為5d；不同組別顯露期存在較大差異，最短為4d，最長(zhǎng)為15d，多數(shù)為5d-9d；排卵囊高峰集中出現(xiàn)在感染后第7d-11d。第二次排卵囊高峰出現(xiàn)在第一次結(jié)束后1-2d，持續(xù)4-6d，排卵囊量明顯小于第一個(gè)高峰期。試驗(yàn)表明

12、，仔豬感染豬等孢球蟲(chóng)后，其潛隱期，顯露期和感染強(qiáng)度與感染劑量存在相關(guān)性，感染劑量越大，潛隱期和顯露期越短，OPG值也越大；感染劑量越小，潛隱期和顯露期越長(zhǎng)，OPG值越小。
　　 4、應(yīng)用純種豬等孢球蟲(chóng)(Isospora suis)孢子化卵囊人工感染9頭6日齡仔豬，利用sysmex sf-3000全血細(xì)胞分析儀和日立7060型全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)了感染前1 d和感染后1，3，6，9，11 d時(shí)血液生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明：仔豬感

13、染I.suis后，白細(xì)胞數(shù)在感染后1 d開(kāi)始增多，11 d達(dá)最高；紅細(xì)胞在感染后3 d開(kāi)始減少，9 d最低，11 d時(shí)恢復(fù)到感染前水平。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性逐漸升高，感染后11 d時(shí)達(dá)最高值；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶感染后6 d升高并達(dá)到最高；感染后1 d堿性磷酸酶活性下降，11 d最低；血清乳酸脫氫酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、α-羥丁酸脫氫酶活性均呈下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。感染后1 d時(shí)白蛋白含量下降，至11 d恢復(fù)到正常水平；球蛋白含量持續(xù)下降

14、，但差異不顯著。血清葡萄糖含量升高但無(wú)顯著變化。感染后1-3 d時(shí)血清尿素氮含量降低，之后逐漸升高，至11 d時(shí)達(dá)最高；尿酸在感染后1-3 d升高，之后持續(xù)下降，至11 d時(shí)最低。血清總膽固醇持續(xù)降低；甘油三酯在感染后1-9 d升高，11d時(shí)恢復(fù)到感染前水平。血清K+含量在感染后持續(xù)降低，但差異不顯著。嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積、總蛋白含量、Na+、Cl-、Ga2+、Mg2+含量均無(wú)明顯變化。
　　 5、為

15、了研究仔豬感染豬等孢球蟲(chóng)后T細(xì)胞亞群的變化規(guī)律，應(yīng)用純種豬等孢球蟲(chóng)孢子化卵囊人工感染9頭6日齡仔豬，分別檢測(cè)了感染前和感染后1、3、6、9、11d(DPI)外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞。結(jié)果顯示，DPI3，CD3+、CD4+T細(xì)胞增加，之后下降，但差異均不顯著(P>0.05)；CD8+T細(xì)胞在DPI6增加，DPI9達(dá)峰值(P<0.05)。CD4+/CD8+值在DPI6下降，DPI11達(dá)到最低點(diǎn)。表明DPI3感染仔豬的免疫功

16、能有所增強(qiáng)，DPI8后仔豬免疫功能受到抑制。
　　 6、為了解豬等孢球蟲(chóng)的內(nèi)生發(fā)育及其對(duì)仔豬的致病性，45頭無(wú)球蟲(chóng)仔豬分為5.0×10P、1.0×105、1.0×104、5.0×104、1.0×105、1.5×105、2.0×105、5.0×105、1.0×106個(gè)·頭-1孢子化豬等孢球蟲(chóng)卵囊9個(gè)劑量感染組，于仔豬3日齡時(shí)一次經(jīng)口感染，另設(shè)2個(gè)不感染空白對(duì)照組，每組5頭仔豬。結(jié)果顯示，豬等孢球蟲(chóng)以?xún)?nèi)芽生增殖形成雙核的Ⅰ型裂殖體及

17、裂殖子和多核的Ⅱ型裂殖體及裂殖子；蟲(chóng)體主要寄生于空腸中、后段和回腸的黏膜上皮細(xì)胞帶蟲(chóng)空泡內(nèi)，偶見(jiàn)于腸隱窩內(nèi)；未見(jiàn)大配子體的嗜曙紅造壁體；產(chǎn)生薄壁型和厚壁型2種卵囊；薄壁型卵囊壁常在孢子化過(guò)程中皺縮或皺裂。接種不同劑量卵囊的仔豬，其臨床癥狀表現(xiàn)不同但均出現(xiàn)腹瀉癥狀。隨感染劑量加大，臨床癥狀加重，糞便記分值增大，死亡率升高，大劑量感染仔豬增重率顯著降低；低劑量感染仔豬顯露期出現(xiàn)在腹瀉之后，高劑量感染顯露期與腹瀉幾乎同時(shí)出現(xiàn)。表明豬等孢球蟲(chóng)對(duì)

18、仔豬具有較強(qiáng)的致病性。
　　 7、從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載5條已發(fā)布的等孢球蟲(chóng)18s rRNA基因序列(I.suisISU97523、I.beill DQ060658、I.ohioensis AF029303、I.felis L76471、I.robiniAF080612)，用OMIGA2.0軟件比對(duì)，生成一條一致性序列，再用軟件Primer premier5.0設(shè)計(jì)一套套式-PCR引物，并對(duì)退火溫度、Mg2+濃度、dNTP

19、量、模板量、引物濃度等進(jìn)行了優(yōu)化。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的引物可以從豬等孢球蟲(chóng)及艾美爾球蟲(chóng)中擴(kuò)增得到明亮的目的條帶，亦可擴(kuò)增出弓形蟲(chóng)但不能擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)，而均不能從常見(jiàn)的腸道細(xì)菌(Escherichia coli，Clostridieum welchii，Chain coccus)中擴(kuò)增出任何目的條帶。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，引物可從相當(dāng)于0.5個(gè)卵囊的DNA樣品中擴(kuò)增出明亮條帶。模擬田間試驗(yàn)表明，所設(shè)計(jì)的PCR方法對(duì)糞便中等孢球蟲(chóng)的檢出

20、率明顯高于MacMaster's法；而且反應(yīng)體系可以從大約含135個(gè)卵囊的糞樣中提取并擴(kuò)增出目的基因條帶。利用所建立的PCR方法體系，并借助MEGA4.0軟件對(duì)河南省4個(gè)地區(qū)的豬等孢球蟲(chóng)分離株以及一個(gè)傳代株進(jìn)行了種系發(fā)育關(guān)系研究，結(jié)果顯示，河南省豬等孢球蟲(chóng)分離株之間沒(méi)有序列差異，同源性為100％；進(jìn)化樹(shù)上5個(gè)分離株處于單一進(jìn)化分支。本試驗(yàn)所建立的套式-PCR方法可用于豬等孢球蟲(chóng)的分子流行病學(xué)和種系發(fā)育關(guān)系研究。
　　 8、為評(píng)價(jià)

21、百球清對(duì)仔豬等孢球蟲(chóng)病的治療效果，對(duì)自然感染豬等孢球蟲(chóng)的7日齡仔豬，分別以15mg·頭·次-1、12.5mg·頭·次-1劑量4次灌服百球清。結(jié)果，其平均抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)分別為1.387和1.322，糞便檢查分別在給藥后第2d、第3d卵囊轉(zhuǎn)陰，治愈率達(dá)100％，表明百球清對(duì)仔豬等孢球蟲(chóng)病具有良好的治療效果。
　　 9、為評(píng)價(jià)百球清對(duì)仔豬等孢球蟲(chóng)病的預(yù)防和治療效果，對(duì)有豬等孢球蟲(chóng)病史豬場(chǎng)的3日齡仔豬和臨床發(fā)病的仔豬群，以20-2

22、5mg·kg-1劑量1次灌服百球清，結(jié)果：藥物預(yù)防仔豬均未感染球蟲(chóng)且增重效果明顯?；疾∽胸i在用藥后第3-4d癥狀消失，卵囊轉(zhuǎn)陰率均為100％，增重率提高11.63％-13.99％，ACI在1.357-1.380，表明對(duì)臨床仔豬等孢球蟲(chóng)病具有良好治療效果。根據(jù)豬等孢球蟲(chóng)病流行特點(diǎn)并結(jié)合本課題研究成果，制定了“飼養(yǎng)管理科學(xué)化、獸醫(yī)衛(wèi)生制度化、驅(qū)蟲(chóng)防疫規(guī)范化”的仔豬等孢球蟲(chóng)病綜合防治措施，并在河南省的鄭州、洛陽(yáng)、開(kāi)封3市部分規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行了實(shí)