豬等孢球蟲的分離鑒定及其防治藥物的效力試驗.pdf

1、豬球蟲病是由豬等孢球蟲（Isospora suis）和某些艾美耳屬（Eimeria）球蟲寄生于仔豬小腸上皮細胞內(nèi)引起的一種以腹瀉為主要特征的寄生性原蟲病，呈世界性分布。在歐美國家，豬等孢球蟲是引起7～14日齡仔豬腹瀉的主要病原。豬等孢球蟲病的臨床癥狀與其他病原引起的仔豬腹瀉很相似，在診治上易產(chǎn)生誤診。由于球蟲具有嚴格的宿主特異性，因此對豬球蟲病的研究只能以豬作為模型動物。然而，用豬作為模型動物的試驗研究管理難度較大，同時豬球蟲的繁殖率又

2、較低以及哺乳動物球蟲的人工感染試驗研究的不確定性，所以對豬球蟲病的研究相對較少。目前，豬等孢球蟲病的防治多選用磺胺類藥物，但其治療效果不確定;在傳統(tǒng)分類上，豬等孢球蟲隸屬艾美耳科(Eimeriidae)、等孢球蟲屬（Isospora），但隨著對其他哺乳動物等孢球蟲的生活史研究，認為哺乳動物的等孢球蟲為成囊類球蟲，與鳥類的等孢球蟲不同。為此，本文就豬等孢球蟲的生物學特性及其種系發(fā)育關(guān)系進行了研究與分析，并通過人工感染試驗評價了妥曲珠利對豬

3、等孢球蟲病的效力，為豬等孢球蟲病的防治提供理論與實驗依據(jù)，也為豬等孢球蟲的分類位置提供依據(jù)。
　　1.豬等孢球蟲純種株的分離鑒定及其生物學特性的研究
　　為了了解豬等孢球蟲的生物學特性和排卵囊規(guī)律，對純種卵囊進行分離與鑒定后，分別用4×102個和1×104個豬等孢球蟲孢子化卵囊感染24日齡無球蟲感染的仔豬，感染后觀察豬的臨床癥狀及球蟲的潛隱期、顯露期和排卵囊量。結(jié)果顯示，仔豬感染4×102個卵囊后未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，感染1

4、×104個卵囊后第6天出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁，食欲不振，皮膚灰白，排灰色的稀糞。感染后第12d癥狀好轉(zhuǎn)。仔豬感染4×102個與1×104個卵囊的排卵囊規(guī)律基本相似，潛隱期均為5d，顯露期分別為7d和18d，排卵囊高峰期分別是在感染后第7～10 d和第7～12 d。感染4×102個孢子化卵囊時每頭豬的排卵囊總數(shù)為1.27×106個，感染1×104個孢子化卵囊時每頭豬的排卵囊總數(shù)分別為6.47×106、6.37×106個。結(jié)

5、果表明本文建立的豬等孢球蟲蟲株（命名為豬等孢球蟲揚州株）對仔豬有致病性，可用于豬球蟲病的研究。
　　2.豬等孢球蟲揚州株18S rRNA基因的克隆與系統(tǒng)發(fā)育分析
　　為了從分子水平上證實本文建立的等孢球蟲蟲株確實是豬等孢球蟲，并探討豬等孢球蟲揚州株與其他球蟲間的親緣關(guān)系，首先通過PCR擴增、DNA片段的克隆及測序，獲得豬等孢球蟲揚州株的18S rRNA序列;然后比較該序列與GenBank中豬等孢球蟲及相近種屬原蟲18S rR

6、NA基因間的同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示，豬等孢球蟲揚州株的18S rRNA序列與另一株豬等孢球蟲的同源性為99.8％，與其他哺乳動物等孢屬球蟲的同源性也都在98％以上;豬等孢球蟲與弓形蟲屬、新孢子蟲屬等成囊類原蟲構(gòu)成一個姊妹群，兩者構(gòu)成一個分支后又同住肉孢子蟲屬原蟲形成姊妹群;而艾美耳屬球蟲與鳥類等孢屬球蟲間的親緣關(guān)系較近，兩者形成一個分支后與前者間形成姊妹群。
　　3.豬等孢球蟲揚州株ITS區(qū)序列的克隆與系統(tǒng)發(fā)育分析

7、
　　為了進一步探討豬等孢球蟲的分類位置，對豬等孢球蟲揚州株的ITS區(qū)序列進行PCR擴增、克隆并測序，將得到的ITS序列與GenBank中豬等孢球蟲及相近種屬原蟲ITS區(qū)基因序列進行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示:豬等孢球蟲的ITS區(qū)基因序列與其他成囊類等孢球蟲同源性較高為88.3％～91.6％，與弓形蟲、新孢子蟲的同源性為51.0％～51.5％，與哈蒙德蟲的同源性為45.8％～49.2％，與禽源的雞艾美耳球蟲的同源性

8、為43.4％～48.0％;將得到的ITS-1序列與GenBank上等孢屬序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，豬等孢球蟲揚州株的ITS-1序列與豬等孢球蟲(EU124685)的同源性為99.0％，與其他等孢屬球蟲的同源性為74.5％～94.5％，與弓形蟲的同源性為32.6％～35.3％。結(jié)論:與以18SrRNA基因為分子標記的分類結(jié)果相同，在分子水平上哺乳動物等孢球蟲屬于肉孢子蟲科，鳥類等孢球蟲屬于艾美耳科。
　　4.妥曲珠利觸變型混懸液對哺乳仔

9、豬等孢球蟲病的療效試驗
　　為了評價妥曲珠利觸變型混懸液對仔豬等孢球蟲病的治療效果，將新出生的6窩仔豬隨機設(shè)為妥曲珠利觸變型混懸液高劑量組(40 mg/kg)、中劑量組（20 mg/kg）和低劑量組（10 mg/kg）、妥曲珠利混懸液對照組(20 mg/kg)、陽性對照組和陰性對照組。出生后第4天感染豬等孢球蟲揚州株10000個孢子化卵囊，第6d按設(shè)計及規(guī)定劑量經(jīng)口一次給藥，隨后分別從臨床癥狀、糞便粘度與腹瀉率、排卵囊數(shù)與卵囊減少

10、率、仔豬體重變化以及組織病理學等參數(shù)來評價藥效。試驗重復(fù)一次。試驗結(jié)果:妥曲珠利觸變型混懸液高劑量藥物組、中劑量藥物組、百球清、陰性組在試驗過程中未出現(xiàn)腹瀉，在糞便中也沒有檢測到卵囊排出，4個組組間增重差異不顯著;而低劑量組在試驗過程中出現(xiàn)輕微腹瀉，并有少量卵囊排出。而陽性組病變明顯，排出大量卵囊，增重與陰性組比較差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論:妥曲珠利觸變型混懸液和百球清對豬等孢球蟲有良好的療效，妥曲珠利觸變型混懸液的臨床推薦劑量為2