甘蔗梢腐病原菌——串珠鐮刀菌分子生物學(xué)研究初探.pdf

1、串珠鐮刀菌(Fusarium moniliformis)引起的甘蔗梢腐病是甘蔗生產(chǎn)過程中一種常見病害。1921在印度尼西亞爪哇首次報道了該病。目前幾乎所有甘蔗生產(chǎn)國和地區(qū)都有該病發(fā)生。并引起了比較的嚴(yán)重的病害，造成了一定的損失(張國棉，2009)。
　　 本文研究了該病病原菌串珠鐮刀菌的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化技術(shù)。文中對液體高度、離心力、離心管大小、離心機升速與減速的快慢、離心管穴傾角、不同洗滌劑等因素對原生質(zhì)體活性、沉淀松緊度及壁

2、效應(yīng)的影響進行了研究；文中還研究了不同復(fù)蘇時間對原生質(zhì)體再生的影響，以及不同酶濃度及不同酶對原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響；文中也介紹了一種離心管平衡的方法。
　　 為了了解各個基因的各種功能，筆者使用TrpC啟動子+hph(Hygromycinphosphtotransferase，hph))基因的ORF的DNA PCR擴增片段對原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化子插入位點的側(cè)翼序列進行克隆。共獲得三個轉(zhuǎn)化子的插入片段側(cè)翼序列。其它擴增到的側(cè)翼序

3、列則主要為載體上的序列和用于轉(zhuǎn)化的片段間互相搭橋形成的序列。因此用該法進行隨機插入仍要求改進。
　　 MAPK途徑與真菌生長發(fā)育、有性生殖、分生孢子產(chǎn)生等相關(guān)。絲氨酸蛋白酶是分解蛋白質(zhì)的酶。病原菌分泌的絲氨酸蛋白酶，可能是病原菌的毒性因子。這兩類基因都可能與病原菌致病相關(guān)。為了尋找與致病相關(guān)基因，本文對串珠鐮刀菌的MAPK途徑基因和絲氨酸蛋白酶基因進行了研究。
　　 通過同源重組進行基因敲除，作者共獲得于A149三個MA

4、PK途徑基因的敲除突變體。對這些突變體進行表型分析發(fā)現(xiàn)：FVEG_02618.3敲除突變體生長速度沒有變化；菌落形態(tài)沒有太大變化；對鹽分比較敏感；致病性略有下降；產(chǎn)孢沒有太大變化。FVEG_03043.3的敲除突變體菌落生長明顯變慢，為野生型的三分之一；菌落顏色加深；當(dāng)氯化鈉濃度為0.5M時，菌落生長速度較在氯化鈉濃度為0M時生長速度加快，但比野生型仍然減慢；分生孢子產(chǎn)生情況沒有太大變化；致病性也沒有太大變化。FVEG_04168.3的

5、敲除突變體生長速度、菌落形態(tài)與野生型相比沒有差異；突變體的致病性沒有變化。分生孢子產(chǎn)生也沒有變化。突變體對鹽濃度極敏感。在含0.5M的氯化鈉下培養(yǎng)基就不生長。作者獲得了FN28一個絲氨酸蛋白酶基因FVEG_00212.3的敲除突變體。表型分析說明敲除突變體的生長速度沒有太大變化，菌落顏色明顯加深，氣生菌絲明顯減少，菌絲易早期死亡，分生孢子產(chǎn)生沒有太大變化，致病性也沒有太大變化。作者也獲得了該基因的過表達(dá)突變體。過表達(dá)突變體致病性、產(chǎn)孢、