水稻miR393基因家族的表達(dá)模式及其對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響.pdf

1、植物microRNA-靶基因相互作用參與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，影響植株各個(gè)階段的形態(tài)構(gòu)成和生長(zhǎng)發(fā)育。miR393的靶基因?yàn)門IR1生長(zhǎng)素受體基因家族，直接調(diào)控對(duì)生長(zhǎng)素的感受。迄今，單子葉植物生長(zhǎng)素受體TIR1的功能研究尚未報(bào)道。本文以單子葉模式生物水稻為研究材料，揭示miR393基因家族成員的表達(dá)模式以及miR393/靶基因TIR1表達(dá)改變對(duì)水稻植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，并且運(yùn)用RNAi技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行功能鑒定，進(jìn)而分析miR393

2、表達(dá)改變的株系對(duì)外源生長(zhǎng)素處理的反應(yīng)。本研究主要結(jié)果如下：
　　 1．水稻miR393基因家族的表達(dá)模式：a）提取水稻不同時(shí)期不同組織的總RNA；b)根據(jù)miR393a和miR393b的前體序列，分別設(shè)計(jì)引物，利用Real timeRT-PCR法測(cè)定pre-miRNA的積累水平；c）根據(jù)miR393的成熟體設(shè)計(jì)特異探針，Northem blot檢測(cè)成熟miR393在不同組織中的積累情況。結(jié)果顯示，miR393a主要在地下部分的不

3、定根中表達(dá)，而miR393b主要在地上部分的莖尖分生組織、旗葉和幼穗中表達(dá)。說(shuō)明水稻miR393基因家族成員具有不同的表達(dá)模式。
　　 2．水稻miR393基因家族的啟動(dòng)子活性分析：克隆水稻miR393a和miR393b莖環(huán)序列上游2-2.5kb的片段，構(gòu)建連接GUS報(bào)告基因的啟動(dòng)子分析載體：pmiR393a:GUS和pmiR393b::GUS，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因株系的GUS染色結(jié)果表明，miR393a主要

4、在不定根和側(cè)根原基、莖尖分生組織和花藥中表達(dá)，而miR393b只在莖尖分生組織中表達(dá)。該結(jié)果表明，水稻miR393a和miR393b基因在水稻植株中的轉(zhuǎn)錄活性存在明顯的組織特異性。
　　 3．過(guò)量表達(dá)miR393對(duì)水稻植株發(fā)育的影響：a）克隆水稻內(nèi)源miR393基因家族的兩個(gè)成員miR393a和miR393b，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體35S::miR393a和35S::miR393b，并轉(zhuǎn)化水稻；b）篩選出miR393a和miR393b的

5、單拷貝過(guò)量表達(dá)株系。對(duì)過(guò)表達(dá)miR393a和miR393b的T3代轉(zhuǎn)基因株系的表型進(jìn)行觀察和分析，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR393嚴(yán)重干擾水稻的生長(zhǎng)和發(fā)育，主要表現(xiàn)在植株矮小，旗葉下坡，分蘗增加，穎殼開裂，主根增長(zhǎng)以及不定根數(shù)減少。
　　 4．通過(guò)模擬靶基因來(lái)抑制miR393作用的MIM393轉(zhuǎn)基因株系的獲得：設(shè)計(jì)引物克隆擬南芥IPS1基因及在IPS1的互補(bǔ)序列用來(lái)模擬miR393的靶位點(diǎn)(MIM393)，構(gòu)建抑制miR393作用的過(guò)

6、表達(dá)載體35S:MIM393，并轉(zhuǎn)化水稻。通過(guò)半定量以及定量RT-PCR鑒定，篩選出4株高表達(dá)MIM393株系。
　　 5．水稻miR393的靶基因的鑒定：采用生物信息學(xué)的方法尋找miR393的靶基因，初步推測(cè)水稻miR393的兩個(gè)靶基因Os04932460.1和Os05905800.1，根據(jù)序列聚類分析分別命名為OsAFB2和OsTIRI。通過(guò)定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)OsAFB2和OsTIRJ在過(guò)表達(dá)miR393轉(zhuǎn)基因株系中

7、的表達(dá)顯著下調(diào)，而且OsTIRJ在35S:MIM393轉(zhuǎn)基因株系旗葉中的表達(dá)顯著上調(diào)。說(shuō)明miR393在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控OsAFB2和OsTIR1的表達(dá)。
　　 6．通過(guò)RNAi抑制OsAFB2和OsTIR1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得：構(gòu)建p35S:RNAi-OsAFB2、p35S:：RNAi-OsTIR1和p35S:：RNAi-OsAFB2-OsTIR1載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，分別得到22株、18株和13株再生植株，進(jìn)

8、一步驗(yàn)證OsAFB2和OsTIR1基因表達(dá)抑制對(duì)水稻植株發(fā)育的影響。
　　 7．過(guò)量表達(dá)miR393增加對(duì)生長(zhǎng)素反應(yīng)的抗性：a）在添加2.5mg/l2，4-D的N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)三周后，野生型種子誘導(dǎo)出愈傷組織，而35S::miR393a和35S::miR393b轉(zhuǎn)基因株系的種子仍未能誘導(dǎo)愈傷組織，表明miR393的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)對(duì)外源生長(zhǎng)素的抗性：b）對(duì)水稻幼苗的2，4-D處理實(shí)驗(yàn)顯示，miR393b的表達(dá)顯著上調(diào)，而miR393a