豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定及其發(fā)病模型的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirus type2,PCV2）是豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus associated disease,PCVAD）的主要病原體。其中，斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）是PCVAD的一種主要的表現(xiàn)形式。它主要感染6周齡～18周齡的豬，臨床癥狀為消瘦、生長遲緩、呼吸困難和腹股溝淺淋巴結(jié)腫大。在我國，PMWS于2000年首次報(bào)道，目前在全國各地廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)

2、濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型體外分離培養(yǎng)病毒滴度低且傳代不穩(wěn)定。此外，臨床上PCV2常與其他病原混合感染，很難利用單純的PCV2成功復(fù)制病例。因此，分離能在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的PCV2毒株，并利用此毒株建立一個(gè)穩(wěn)定的PCV2發(fā)病模型，是PCV2致病機(jī)理研究以及基因工程疫苗評價(jià)的重要前提。
　　本研究對多份病料組織樣品進(jìn)行PCV2特異性PCR檢測，鑒定結(jié)果呈陽性的接種到PK-15細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離。利用間接免疫熒光試驗(yàn)對接種PCV2的細(xì)胞進(jìn)

3、行檢測同時(shí)對PCV2分離毒株進(jìn)行序列測定和分析，以確定所分離毒株為PCV2。建立熒光定量PCR方法，用于測定不同培養(yǎng)方法的傳代毒株的拷貝數(shù)，確立適宜PCV2體外增殖的培養(yǎng)方式。
　　研究結(jié)果表明：
　?。?）通過PCR特異性檢測和間接免疫熒光試驗(yàn)確定分離出5株P(guān)CV2毒株，并命名為311-JS01、312-JS02、FJ-JS03、119-GD01和YJ-GD02；
　?。?）測序結(jié)果顯示有3株分離株全基因長度為176

4、6 bp（311-JS01、312-JS02和FJ-JS03），2株（119-GD01和YJ-GD02）為1767 bp株；
　?。?）通過序列比對分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，確定分離株中311-JS01、312-JS02、FJ-JS03和119-GD01屬于PCV2b亞型1C分支，YJ-GD02屬于PCV2b亞型1A/1B分支。5株分離株的同源性在95.7％~99.9%之間，與國內(nèi)外21株參考毒株同源性在95.0%~99.0%之間，

5、親緣關(guān)系相近，不具備顯著的地區(qū)相關(guān)性；
　　（4）確定了適宜分離株的體外培養(yǎng)方式：同步接毒24 h后，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖作用處理25 min后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。5株P(guān)CV2毒株的成功分離為PCV2的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、疫苗開發(fā)等研究奠定了基礎(chǔ)。
　　利用119-GD01株通過滴鼻和頸部肌肉注射對商品豬（ELISA抗體滴度1:100以下）進(jìn)行人工感染，在攻毒前3 d、攻毒后第4、7 d用匙孔藍(lán)蛋白（KLH）

6、肌注和巰基乙酸腹腔注射同時(shí)進(jìn)行刺激，在攻毒后第11、18 d再次腹腔注射巰基乙酸，設(shè)立陰性對照組，于攻毒后第28 d剖殺所有實(shí)驗(yàn)豬。
　　攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明：
　?。?）在攻毒后2周內(nèi)，免疫刺激攻毒組的體溫普遍高于對照組；
　?。?）免疫刺激攻毒組在攻毒后第7 d開始出現(xiàn)病毒血癥，于攻毒后25 d消失，血清學(xué)陽轉(zhuǎn)發(fā)生在攻毒后第18 d；
　?。?）通過熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)從腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟以及脾臟中均能