表達(dá)AMV，WCMV外殼蛋白基因的紅三葉T1，T2代分子生物學(xué)檢測(cè)及抗病性分析.pdf

1、紅三葉病毒病是除根節(jié)線蟲(chóng)之外的一大病害，其中尤以苜?；ㄈ~病毒（Alfalfa Mosaic Virus，AMV）和白三葉花葉病毒（White Clover Mosaic Virus，WCMV）最為猖獗。大面積草地噴施農(nóng)藥不僅成本高，而且會(huì)造成環(huán)境污染，對(duì)畜產(chǎn)品的安全性也有影響。培育抗AMV和WCMV的轉(zhuǎn)基因紅三葉新品種是解決問(wèn)題的根本途徑。要實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的多抗效果，目前常用的方法有：構(gòu)建雙元、多元載體，然后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；給已經(jīng)轉(zhuǎn)入一個(gè)

2、抗性基因的植株用轉(zhuǎn)基因手段再轉(zhuǎn)入另外一個(gè)抗性基因；在不同的抗病轉(zhuǎn)基因植株之間進(jìn)行人工雜交。 本研究以抗苜?；ㄈ~病毒（AMV）轉(zhuǎn)基因紅三葉和抗白三葉花葉病毒（WCMV）的轉(zhuǎn)基因紅三葉人工雜交后代T1，T2代植株為研究對(duì)象，探討目的基因在人工雜交后代中的表達(dá)情況及其抗病性強(qiáng)弱。研究結(jié)果如下； 1）分別用改進(jìn)的CTAB法和植物基因組試劑盒提取34個(gè)T1代植株DNA樣品和30個(gè)T2代植株DNA樣品及1個(gè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA樣品，經(jīng)

3、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有條帶均清晰無(wú)污染，利用試劑盒提取DNA較手提法時(shí)間短、質(zhì)量好。對(duì)提取的30個(gè)T2代植株的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶完整、清晰。 2）34株T1代植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果顯示，5株AMV、WCMV陽(yáng)性，6株WCMV陽(yáng)性，1株AMV陽(yáng)性，3株僅nptⅡ陽(yáng)性。 3）30株T2代PCR檢測(cè)結(jié)果顯示所有T2代植株nptⅡ均呈陽(yáng)性，其中10株AMV、WCMV均陽(yáng)性，13株WCMV陽(yáng)性、3株AMV陽(yáng)性。

4、 4）對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因紅三葉進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，分別得到預(yù)期大小的條帶。其中，9個(gè)正常轉(zhuǎn)錄并表達(dá)AMV和WCMV外殼蛋白基因，3個(gè)表達(dá)AMV外殼蛋白基因，6個(gè)表達(dá)WCMV外殼蛋白基因，3個(gè)表達(dá)nptⅡ基因。 5）30株T2代植株有21株能夠表達(dá)外殼蛋白基因，表明外源基因可以通過(guò)人工雜交遺傳至后代，并在大部分植株中能夠正常轉(zhuǎn)錄，并且，通過(guò)人工雜交能夠?qū)崿F(xiàn)兩種外源基因在同一植株中的累集。 6）對(duì)T2代陽(yáng)性植株進(jìn)行苜?；ㄈ~病