非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立及其桿狀病毒載體疫苗的構(gòu)建.pdf

1、非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起豬和野豬的一種以高熱、淋巴及內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血為特征的急性、熱性、高度接觸傳染性疾病。我國(guó)面臨ASF傳入的風(fēng)險(xiǎn)，因此，開展該病的診斷方法和疫苗的儲(chǔ)備技術(shù)研究具有重要的意義。
　　本研究利用基因工程表達(dá)的ASFV主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白VP73和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為主要材料，建立了可用于大規(guī)模檢測(cè)豬血清

2、臨床樣品中ASFV抗體的間接ELISA方法，為ASFV抗體檢測(cè)提供了有效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，同時(shí)本研究構(gòu)建了表達(dá)ASFVVP73基因的重組桿狀病毒，為ASFV新型疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.ASFVVP73蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備
　　合成ASFVVP73全序列構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-KG-VP73，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的VP

3、73蛋白可以與ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。利用純化的VP73蛋白免疫4周齡BALB/c雌性小鼠制備單克隆抗體。通過間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并最終獲得了兩株穩(wěn)定分泌抗VP73蛋白特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E6和1H3，抗體亞類鑒定分別為IgG2b和IgG1，輕鏈均為κ鏈。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Westernblot分析證實(shí)，獲得的兩株單克隆抗體均能與VP73蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　2.ASFV

4、間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立
　　以VP73純化蛋白作為包被抗原，ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性/陰性血清樣品為檢測(cè)樣品，HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，建立ASFV間接ELISA抗體檢測(cè)方法。結(jié)果表明，本方法對(duì)ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1∶2560;批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10％;包被的酶標(biāo)板在37℃放置5天后，對(duì)同1份陽(yáng)性/陰性血清的檢測(cè)敏感性無明顯變化;與進(jìn)口商品化阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒相比，本方法的特

5、異性和敏感性分別為99.1％和94.3％，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的kappa數(shù)據(jù)值為0.944，符合率較高。
　　3.ASFVVP73基因桿狀病毒載體疫苗的構(gòu)建
　　本研究根據(jù)已發(fā)表的ASFV序列，設(shè)計(jì)合成VP73基因全序列，以巨細(xì)胞病毒極早期啟動(dòng)子(CMV)和經(jīng)水泡性口炎病毒G蛋白(VSV/G)修飾過的pFastBac(I)桿狀病毒為載體構(gòu)建了重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73。Westernblot結(jié)果表明，該病毒感染BHK