不結(jié)球白菜小分子量熱激蛋白基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、遇到高溫脅迫時(shí)植物體內(nèi)會產(chǎn)生應(yīng)激蛋白--熱激蛋白，其中植物小分子量熱激蛋白含量最為豐富、種類繁多。小分子量熱激蛋白的分子量在17～30kDa之間。高等植物中含有至少6種小分子量熱激蛋白，分別定位于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在常溫下植物體內(nèi)小分子量熱激蛋白基因不表達(dá)，高溫時(shí)小分子量熱激蛋白則快速積累。
　　 近年來，關(guān)于高溫誘導(dǎo)熱激蛋白以及熱激蛋白提高植物耐熱性的研究取得了重要進(jìn)展。然而，關(guān)于高溫誘導(dǎo)熱激蛋白基因及其在低溫防

2、御中作用的研究相對較少。本研究從不結(jié)球白菜中分離到小分子量熱激蛋白基因BcHSP，表達(dá)模式和功能分析表明，這個(gè)基因的表達(dá)受高溫逆境誘導(dǎo)，高溫、低溫條件下過量表達(dá)對大腸桿菌均有保護(hù)作用，構(gòu)建了過量表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因初步鑒定，為進(jìn)一步BcHSP基因研究打下基礎(chǔ)。
　　 1.利用同源序列設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR和RACE方法從不結(jié)球白菜葉片中克隆到小分子量熱激蛋白基因的中間片段，通過5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’

3、片段和3’片段，拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長722bpcDNA，命名為BcHSP（DDBJ登錄號：AB367955），ORF為473bp，編碼157個(gè)氨基酸的多肽，理論等電點(diǎn)(pI)為5.31，分子量約為15.98kDa。核苷酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，BcHSP與芥藍(lán)相似性最高達(dá)98％.氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，相似性均在65％以上，說明HSP具有高度保守性。HSP的高度保守性說明他們在生物生命活動(dòng)中具有重要的作用。聚類分析結(jié)果顯示，BcHS

4、P基因與芥藍(lán)(CAB93512)最先聚為一類，親緣關(guān)系最近，蕪菁(AAB72190)單個(gè)聚一類、然后與擬南芥（NP-175759）、豌豆(P19243)、大豆(P02519)等聚為一類，最后與水稻(EAY89381)聚類，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。實(shí)時(shí)定量檢測表明，不結(jié)球白菜BcHSP轉(zhuǎn)錄表達(dá)受熱激誘導(dǎo)，以葉片中表達(dá)量最高，BcHSP在不結(jié)球白菜葉片中表達(dá)特征說明它可能與植物葉片的耐熱性關(guān)系更為密切。
　　 2.不結(jié)球白菜幼苗經(jīng)42℃熱

5、激后，其幼苗的耐冷性明顯增強(qiáng)，膜傷害程度降低。熱激處理組的冷害指數(shù)仍低于對照組，差異顯著(P＜0.05)，并且經(jīng)熱激的幼苗鮮重比對照增加了51％，苗高增加了40％。熱激使不結(jié)球白菜幼苗在冷脅迫和恢復(fù)生長過程中電解質(zhì)的滲透和丙二醛(MDA)含量均比對照大為下降，差異顯著(P＜0.05)，顯示熱激降低了不結(jié)球白菜幼苗的脂質(zhì)過氧化水平，并且使幼苗的抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性在

6、冷脅迫及恢復(fù)生長2d時(shí)仍保持比對照組高，差異顯著(P＜0.05)。熱激處理后與對照組的幼苗SOD同工酶的電泳圖譜顯示，熱激誘導(dǎo)使幼苗在低溫脅迫前后SOD同工酶譜帶均比對照組強(qiáng)，以上與冷害相關(guān)的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示，熱激處理增強(qiáng)了不結(jié)球白菜幼苗的耐冷能力。熒光實(shí)時(shí)定量分析表明BcHSP的表達(dá)量與耐冷性相一致。低溫(4℃)脅迫下，在大腸桿菌中異源表達(dá)BcHSP可維持大腸桿菌較高的細(xì)胞活力，這些結(jié)果表明BcHSP合成與不結(jié)球白菜幼苗耐冷性