不結(jié)球白菜晚抽薹基因BcFLC1，BcFLC3的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、利用已知的抑制抽薹基因的保守序列設(shè)計特異性引物，獲得不結(jié)球白菜晚抽薹BcFLC1，BcFL3基因的全長cDNA序列，為了更好的研究這些基因，對抽薹開花進(jìn)行調(diào)控，本試驗利用熒光定量PCR對其進(jìn)行不同時期，不同部位的表達(dá)分析，并利用Southern雜交技術(shù)對BcFLC3基因在不結(jié)球白菜基因組中的拷貝數(shù)進(jìn)行研究。進(jìn)一步利用該基因開展蔬菜晚抽薹調(diào)控提供了理論和技術(shù)支持。
　　 1不結(jié)球白菜抽薹相關(guān)基因BcFLC1全長克隆與序列分析

2、>　　 以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜課題組提供的不結(jié)球白菜（Brassica campestrisssp.chinensis）‘NJ074’為試材。參照油菜FLC1基因（GenBank登錄號AY036888.1）設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR、5'RACE、3'RACE方法，克隆得到了不結(jié)球白菜‘NJ074’晚抽薹基因BcFLC1，該基因CDNA全長序列909bp，包含有576 bp的開放閱讀框。
　　 采用生物信息學(xué)方法，利

3、用多種在線軟件對BcFLC1蛋白的氨基酸與其他植物抽薹相關(guān)基因的同源性、系統(tǒng)進(jìn)化、親水性、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、所含模體及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果表明：利用DNAMAN軟件分析BcFLC1基因編碼氨基酸序列與其他植物抽薹相關(guān)基因的同源性，結(jié)果表明，BcFLC1與己克隆的植物的抽薹相關(guān)基因均有不同程度同源性，與油菜（AAK70215.1）和大白菜（ABI29999.1）的控制抽薹基因同源序列相似性分別高達(dá)96％和95％，與蘿卜（AAP

4、31676.1）相關(guān)基因相似度為82％，與擬南芥（AAV51217）控制抽薹基因同源序列相似性為86％。理化性質(zhì)分析顯示其編碼194個氨基酸，分子量為21877.6D，pI值為8.71。TMpred跨膜分析顯示，它含有1個顯著的跨膜螺旋區(qū)，這個區(qū)域與ProtSCale預(yù)測的疏水區(qū)基本重疊。用TargetP server和WOLFPSORT server程序預(yù)測該蛋白為細(xì)胞質(zhì)蛋白。結(jié)構(gòu)域分析顯示該蛋白含多種磷酸化位點(diǎn)。二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和

5、隨機(jī)卷曲為主。結(jié)論該研究可為不結(jié)球白菜抽薹蛋白BcFLC1結(jié)構(gòu)和功能的實驗研究提供理論依據(jù)。不結(jié)球白菜BcFLC1蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測分析，結(jié)果表明：該基因為MADS盒基因，其編碼的蛋白1～60aa屬于MADS盒基因蛋白。
　　 通過熒光定量PCR分析表明：BcFLC1基因在不結(jié)球白菜不同生長發(fā)育階段葉片中的表達(dá)情況不同，抽薹前高于抽薹后葉片中的表達(dá)量。BcFLC1基因在不結(jié)球白菜不同部位表達(dá)也存在差異，表達(dá)量從高到低依次為：葉、

6、莖、花蕾、花和根。
　　 2不結(jié)球白菜抽薹相關(guān)基因BcFLC3長克隆與序列分析
　　 參照大白菜BcFLC3基因（GenBank登錄號AY036890.1）保守域序列設(shè)計引物，擴(kuò)增出不結(jié)球白菜晚抽薹BcFLC3基因的核心片段，結(jié)合5'RACE和3'RACE技術(shù)獲得該基因的5'端序列和3'端序列，利用DNAman軟件經(jīng)序列拼接獲得1個全長為1017 bp的CDNA序列，包含完整開放閱讀框，編碼197個氨基酸的蛋白質(zhì)。

7、>　　 采用生物信息學(xué)方法，利用多種在線軟件對BcFLC3蛋白的氨基酸與其他植物抽薹相關(guān)基因的同源性、系統(tǒng)進(jìn)化、親水性、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、所含模體及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果表明：利用DNAMAN軟件分析BcFLC3基因編碼氨基酸序列與其他植物抽薹相關(guān)基因的同源性，結(jié)果表明BcFLC3基因與己克隆的植物的抽薹相關(guān)基因均有不同程度同源性，與甘藍(lán)（AAP31677）的控制抽薹基因同源序列相似性高達(dá)94％，與擬南芥（AAV51217）

8、控制抽薹基因同源序列相似性為79％。理化性質(zhì)分析顯示其編碼197個氨基酸，分子量為21.62kD，pI值為9.36。TMpred跨膜分析顯示，它含有1個顯著的跨膜螺旋區(qū)，這個區(qū)域與ProtScale預(yù)測的疏水區(qū)基本重疊。用TargetP server和WOLFPSORT server程序預(yù)測該蛋白為細(xì)胞核蛋白。結(jié)構(gòu)域分析顯示該蛋白含多種磷酸化位點(diǎn)。二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和隨機(jī)卷曲為主。結(jié)論該研究可為不結(jié)球白菜抽薹蛋白BcFLC3結(jié)構(gòu)和功能的

9、實驗研究提供理論依據(jù)。不結(jié)球白菜BcFLC3蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測分析，結(jié)果表明：該基因為MADS盒基因，其編碼的蛋白1～60aa屬于MADS盒基因蛋白。
　　 通過熒光定量PCR分析表明：BcFLC3基因在不結(jié)球白菜不同生長發(fā)育階段葉片中的表達(dá)情況不同，抽薹前高于抽薹后葉片中的表達(dá)量。低溫春花處理后，BcFLC3基因在不結(jié)球白菜不同部位表達(dá)也存在差異，表達(dá)量從高到低依次為：葉、莖、花蕾、花和根。Southern雜交表明：BcFLC