奶牛耐熱性狀候選基因的遺傳特性分析.pdf

1、本研究目的在于揭示與奶牛耐熱性狀相關(guān)候選基因的分子遺傳機(jī)理,為標(biāo)記輔助選擇耐熱性奶牛新品系提供基礎(chǔ)資料。通過研究不同季節(jié)條件下奶牛部分生理指標(biāo)、生化指標(biāo)及產(chǎn)奶性狀指標(biāo)的變化規(guī)律；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析奶牛外周血淋巴細(xì)胞HDP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表達(dá)水平與耐熱指標(biāo)的相關(guān)性,確定奶牛耐熱性狀的候選基因；選擇牛遺傳圖譜上分別與耐熱性狀相關(guān)候選基因及影響產(chǎn)奶量和乳組成QTL連鎖的7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,分析在奶牛樣本群

2、體的遺傳參數(shù),并運(yùn)用最小二乘擬合一般線性模型與奶牛的耐熱指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；采用PCR-LIS-SSCP和DNA測序技術(shù)檢測奶牛耐熱性狀候選基因ATP1A1基因的SNPs,并研究了其多態(tài)性和奶牛耐熱性狀的關(guān)系。結(jié)果如下:
　　 1.熱應(yīng)激對(duì)奶牛部分生理生化指標(biāo)及產(chǎn)奶性狀的影響
　　 為了研究不同季節(jié)條件下奶牛的部分生理指標(biāo)、血液無機(jī)離子含量、紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活性、血液抗氧化指標(biāo)和產(chǎn)奶性狀的變化規(guī)律,選擇3-5

3、胎次的80頭健康荷斯坦奶牛,根據(jù)夏季直腸溫度和產(chǎn)奶量下降率兩個(gè)指標(biāo)分為耐熱組(直腸溫度在37.5-39.5℃之間,產(chǎn)奶量下降率<10％)和非耐熱組(直腸溫度>39.5℃,產(chǎn)奶量下降率>40％),分別于夏季8月份(牛舍日平均氣溫為32.5℃,THI為84.16)和同年秋季11月份(牛舍日平均氣溫為12.5℃,THI為56.80)條件下,測定直腸溫度、耐熱系數(shù)、呼吸頻率、血液無機(jī)離子含量、血清SOD酶活、血清GSH-px酶活、血清MDA含量

4、、紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活性及產(chǎn)奶性狀等指標(biāo),結(jié)果表明:熱應(yīng)激對(duì)奶牛的部分生理、生化指標(biāo)及產(chǎn)奶性狀影響程度很大,導(dǎo)致直腸溫度升高,呼吸頻率增加,血清Na+和紅細(xì)胞鉀含量下降,紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活性下降,抗氧化能力受到損傷,產(chǎn)奶量下降和體細(xì)胞評(píng)分增高等,其中,直腸溫度、耐熱系數(shù)、紅細(xì)胞鉀含量、紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活、血清SOD酶活、血清GSH-pX酶活、日產(chǎn)奶量在夏季耐熱組與非耐熱組間差異顯著(p<0.05)

5、,表明其與奶牛耐熱性關(guān)系密切,可以作為選育耐熱性奶牛新品系和監(jiān)測熱應(yīng)激程度的參考指標(biāo)。
　　 2.奶牛HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3羅基因mRNA表達(dá)水平與耐熱性關(guān)系的研究
　　 為了研究奶牛HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表達(dá)水平與耐熱性的相關(guān)性,確定奶牛耐熱性狀的候選基因,為揭示奶牛耐熱性狀分子遺傳機(jī)理提供參考。選取16頭3胎次的高產(chǎn)健康荷斯坦奶牛,分為耐熱組和非耐熱組,分別于夏

6、季8月份(牛舍日平均氣溫為32.5℃,THI為84.16)和同年秋季11月份(牛舍日平均氣溫為12.5℃,THI為56.80)條件下,采集奶牛尾靜脈血液,并測定夏季直腸溫度、產(chǎn)奶量下降率和紅細(xì)胞鉀含量作為耐熱指標(biāo)；應(yīng)用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)分析不同溫度條件和不同組別奶牛外周血淋巴細(xì)胞HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表達(dá)水平的差異及其與奶牛耐熱性狀的關(guān)系。結(jié)果表明:與秋季相比,夏季奶牛HSP70

7、、ATP1A1和GPX3的mRNA表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01),SOD3mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；夏季高溫期間,耐熱組的ATP1A1和SOD3基因的mRNA表達(dá)水平極顯著高于非耐熱組(P<0.01),GPX3 mRNA表達(dá)水平顯著高于非耐熱組(P<0.05),而HSP70mRNA表達(dá)水平在二組別間差異不顯著(P>0.05)。相關(guān)分析表明奶牛外周血淋巴細(xì)胞四個(gè)基因mRNA表達(dá)水平與部分耐熱指標(biāo)呈顯著相關(guān)(P<0.05

8、)。因此,可以得出HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3參與了熱應(yīng)激過程中分子水平上的表達(dá)調(diào)控,可能對(duì)奶牛耐熱性起作用,可作為影響奶牛耐熱性狀的候選基因進(jìn)一步研究。
　　 3.奶牛微衛(wèi)星標(biāo)記與耐熱性狀的相關(guān)分析
　　 為了探討微衛(wèi)星DNA作為奶牛耐熱性狀遺傳標(biāo)記的可行性。根據(jù)牛基因組遺傳圖譜,選擇奶牛不同染色體上分別與HSP70、ATP1A1、SOD、GPX3基因和影響產(chǎn)奶量和乳組成的QTL連鎖的微衛(wèi)星座位BMS4

9、68、BM1258、BM1815、BM723、SOD1、BMS2258和D14S31,對(duì)160頭3—5胎次中國荷斯坦奶牛進(jìn)行多態(tài)性檢測,采用最小二乘擬合一般線性模型分析微衛(wèi)星座位與耐熱性狀部分指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。結(jié)果表明:所選7個(gè)微衛(wèi)星座位在該奶牛群體中均表現(xiàn)出豐富的遺傳多態(tài)性,多態(tài)信息含量、遺傳雜合度和有效等位基因數(shù)的平均值分別為0.64089、0.6866和3.2789。微衛(wèi)星座位BMS468與耐熱系數(shù)、產(chǎn)奶量下降率和紅細(xì)胞鉀含量顯

10、著相關(guān)的最有利基因型為134bp/128 bp(P<0.05),與紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活顯著相關(guān)的最有利基因型為140 bp/134 bp(P<0.05)；微衛(wèi)星座位BM1258與產(chǎn)奶量下降率顯著相關(guān),最有利基因型為101bp/99 bp(P<0.05)；微衛(wèi)星座位BM1815與耐熱系數(shù)、紅細(xì)胞鉀含量和紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活顯著相關(guān),最有利基因型為186 bp/148 bp(P<0.05)；微衛(wèi)星座位BM723與產(chǎn)奶

11、量下降率、紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活和紅細(xì)胞鉀含量顯著相關(guān),最有利基因型為161 bp/111 bp(P<0.05)；微衛(wèi)星座位BMS2258與產(chǎn)奶量下降率和血清GSH—px酶活顯著相關(guān),最有利基因型為182 bp/164 bp(P<0.05)；微衛(wèi)星座位SOD1與耐熱系數(shù)和產(chǎn)奶量下降率顯著相關(guān),最有利基因型為148 bp/1486p(P<0.05),與血清SOD酶活顯著相關(guān)的最有利基因型為148 bp/146 bp(P<0.05

12、)；微衛(wèi)星座位D14S31與產(chǎn)奶量下降率顯著相關(guān),最有利基因型為176 bp/152 bp(P<0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)奶牛耐熱性狀有顯著效應(yīng)、多態(tài)性較高的微衛(wèi)星基因座,為開展奶牛耐熱性的標(biāo)記輔助選擇提供了有價(jià)值的遺傳標(biāo)記。
　　 4.ATP1A1基因多態(tài)性及其與奶牛耐熱性狀的關(guān)聯(lián)分析
　　 為了研究ATP1A1基因多態(tài)性及其與奶牛耐熱性狀的相關(guān)性,尋找影響奶牛耐熱性狀的QTL,為分子標(biāo)記輔助選擇奶牛耐熱性新品系提供相

13、應(yīng)依據(jù)。以160頭3-5胎次的健康高產(chǎn)中國荷斯坦奶牛為實(shí)驗(yàn)材料,采取PCR—LIS—SSCP和DNA測序等方法進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)檢測及基因型分析,研究單個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型及不同多態(tài)位點(diǎn)的合并基因型與奶牛耐熱性狀的關(guān)系。結(jié)果表明,與GenBank ATP1A1基因(NC_007301.3)序列比較,ATP1A1基因外顯子5、14和17各發(fā)現(xiàn)一個(gè)沉默SNP突變,分別為-4357bp處A/G、-14103bp處G/A和-15739 bp處C/A；內(nèi)含

14、子5發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP,為-4397bp處T/G；內(nèi)含子14發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP,分別為-14242bp處C/T、-14829處T/-和-14997處G/A,統(tǒng)計(jì)分析表明4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型個(gè)體間的耐熱系數(shù)、產(chǎn)奶量下降率、紅細(xì)胞鉀含量和紅細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活性存在顯著差異；在P5和P17位點(diǎn),AA基因型為各自位點(diǎn)上的耐熱性狀最有利基因型,在P14和P15位點(diǎn),AC基因型為各自位點(diǎn)上的耐熱性狀最有利基因型。合并基因型與耐熱性狀的關(guān)聯(lián)分