Bradyrhizobium diazoefficiens 4534和4222菌株選擇性結(jié)瘤的分子生物學(xué)機(jī)理比較研究.pdf

1、根瘤菌選擇性結(jié)瘤的分子機(jī)理是長(zhǎng)期關(guān)注的熱點(diǎn)，也是制約根瘸菌發(fā)揮固氮應(yīng)用潛能的關(guān)鍵所在。多年的研究初步掌握了根瘤菌選擇性結(jié)瘤的基本過(guò)程及其影響因子，并獲得了多個(gè)與根瘤菌共生、固氮和選擇性結(jié)瘤相關(guān)的基因。但是對(duì)根瘤菌株基因之間的相互聯(lián)系、菌株基因的遺傳、調(diào)控和表達(dá)差異以及基因與宿主的相互作用等方面缺乏全面系統(tǒng)的了解。本研究以與大豆品種中黃13存在結(jié)瘤能力顯著差異的Bradyrhizobium diazoefficiens的兩株菌為材料，在比

2、較基因組學(xué)的基礎(chǔ)上，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行了大豆根系分泌物處理下的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)差異分析，以進(jìn)一步揭示根瘤菌的選擇性結(jié)瘤機(jī)理及其主要影響因子。本研究取得主要結(jié)果如下:
　　1.本研究設(shè)計(jì)并改進(jìn)了一種高效促進(jìn)大豆結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法。根瘤菌誘導(dǎo)試驗(yàn)的難點(diǎn)之一就是如何獲得有效的大豆根際分泌誘導(dǎo)物，這是保證后續(xù)研究結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的關(guān)鍵因素。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、改進(jìn)并最終獲得了一種高效促進(jìn)大豆結(jié)瘤的大豆根系分泌物

3、的制備方法，提高了分泌物的收集提取效率。應(yīng)用上述所建立的技術(shù)方法成功收集了中黃13的根系分泌物，經(jīng)其誘導(dǎo)后菌株的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果證明，所建立根系分泌物制備可行高效。
　　2.完成了B.diazoefficiens4534和B.diazoefficiens4222基因組測(cè)序，初步了解了它們的基因組特性?；蚪M分析表明它們均由一個(gè)單復(fù)制子構(gòu)成，染色體上各含有三個(gè)核糖體操縱子，G+C含量分別為65.0％和64.9％，基因的平均長(zhǎng)

4、度分別為903 bp和901 bp，分別預(yù)測(cè)出8072個(gè)和8233個(gè)ORF;但兩基因組中均有近一半未知功能的ORF，為系統(tǒng)分析根瘤菌基因信息帶了一定困難;分析發(fā)現(xiàn)兩菌株間在直系統(tǒng)同源基因上有大量差異，這可能與結(jié)瘤差異等過(guò)程相關(guān)。
　　3.首次從比較基因組層面較深入系統(tǒng)揭示了大豆根瘤菌B.diazoefficiens4534和B.diazoefficiens4222選擇性結(jié)瘤能力差異的可能分子差別。比較分析基因組發(fā)現(xiàn)這兩菌株間存在大

5、量差異直系統(tǒng)同源基因，顯示它們選擇性結(jié)瘸能力差異的可能分子差別，主要涉及脯氨酸代謝、甘露醇、磷酸鹽和鉬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、群集效應(yīng)和IAA代謝等過(guò)程。這可能是含有更多功能基因的B.diazoefficiens4534菌株具有更高的選擇性結(jié)瘸能力的潛在原因。
　　4.較全面開展了大豆根瘤菌B.diazoefficiens4534和B.diazoefficiens4222選擇性結(jié)瘤分子機(jī)理的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果表明:在大豆根系分泌物的處理下，菌

6、株4534有65個(gè)差異表達(dá)蛋白，菌株4222有29個(gè)差異表達(dá)蛋白。與菌株4222相比，菌株4534產(chǎn)生更多種類和數(shù)量上的差異蛋白;差異蛋白的分析推斷，可能是S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）、PhyRσEcfG調(diào)節(jié)子、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鞭毛蛋白、分子伴侶、與氧化還原狀態(tài)維持相關(guān)的蛋以及一些未知蛋白使得B.diazoefficiens4534具有更高的選擇性結(jié)瘤能力;大豆根系分泌物的作用不僅局限于對(duì)大豆根瘤菌結(jié)瘤基因表達(dá)的誘導(dǎo)，還與新陳代謝

7、和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的蛋白/酶的表達(dá)正相關(guān)。
　　5.完成了B.diazoefficiens4534和B.diazoefficiens4222轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明:在根系分泌物的誘導(dǎo)下菌株4534有457個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因253個(gè)，下調(diào)基因204個(gè)。而菌株4222只有293個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因108個(gè)，下調(diào)基因185個(gè);兩菌株差異表達(dá)基因的GO功能富集分類、代謝途徑分析和KEGG富集分析結(jié)果顯示，在根系分泌物的