第18章遺傳疾病的診斷_第1頁(yè)
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1、<p>  第十八章 遺傳病的診斷</p><p>  遺傳病診斷是一項(xiàng)復(fù)雜的工作,需要多學(xué)科的密切配合。遺傳病的診斷包括常規(guī)診斷和特殊診斷。常規(guī)診斷指與一般疾病相同的診斷方法,特殊診斷是指采用遺傳學(xué)方法,包括染色體檢查,家系分析等,是遺傳病確診的關(guān)鍵。目前,臨床上遺傳病診斷包括:臨癥診斷、癥狀前診斷(presymptomatic diagnosis)、出生前診斷和植入前診斷。</p>&

2、lt;p><b>  第一節(jié) 臨癥診斷</b></p><p>  臨癥診斷(symptomatic diagnosis)是根據(jù)患者的各種臨床表現(xiàn)進(jìn)行分析,確診并判斷遺傳方式,是遺傳病診斷的主要內(nèi)容。</p><p>  一、病史、癥狀和體征</p><p><b>  (一)病史</b></p>&l

3、t;p>  遺傳病大多有家族聚集傾向,因此病史的采集非常重要。在采集病史時(shí)要準(zhǔn)確、詳盡。另外還要收集病人的家族史、婚姻史和生育史等相關(guān)信息。遺傳病史的采集比其他疾病更重要,因?yàn)檫z傳病的家族聚集性和其傳遞的規(guī)律性決定了病史采集可能會(huì)獲得更有用的信息,對(duì)后續(xù)的分析工作可能會(huì)有很大的幫助。病史采集的關(guān)鍵是材料的真實(shí)性和完整性。病史采集,主要是通過(guò)采集對(duì)象的描述和有關(guān)個(gè)體的病案查詢工作來(lái)完成。實(shí)踐中還應(yīng)注意不同個(gè)體描述是否可以相互印證,以

4、確定資料的可信度。對(duì)于發(fā)病原因、過(guò)程、時(shí)間、地點(diǎn)、治療情況等也應(yīng)詳細(xì)記錄。</p><p><b> ?。ǘ┌Y狀與體癥</b></p><p>  遺傳病除了具有其他疾病相同的體征外,還有特異性征候群,這些都為初步診斷提供線索。大多遺傳病在嬰兒和兒童期有相應(yīng)的體征和癥狀,如Down綜合征患兒的特殊面容和智力低下等,當(dāng)然還需要通過(guò)染色體檢查進(jìn)一步確診。</p&g

5、t;<p><b>  二、家系分析</b></p><p>  根據(jù)對(duì)患者及家族成員發(fā)病情況的調(diào)查結(jié)果繪制系譜,確定單基因病或多基因病,遺傳方式等。系譜分析時(shí)應(yīng)注意:系譜的完整性和準(zhǔn)確性;單基因遺傳病的分析非常有用,常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病,X連鎖顯性遺傳病,X連鎖隱性遺傳病,Y連鎖遺傳病。單基因遺傳分析中要注意外顯不全,延遲顯性,顯、隱性的相對(duì)性,新的突變產(chǎn)生

6、,遺傳印記,動(dòng)態(tài)突變,以及遺傳異質(zhì)性等問(wèn)題,避免判斷上的錯(cuò)誤和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的錯(cuò)誤估計(jì)。</p><p>  線粒體遺傳病通過(guò)母系遺傳,主要特點(diǎn)是晚發(fā),進(jìn)行性。多基因病是一大類常見(jiàn)的疾病,有家族聚集傾向,但不遵循孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律。</p><p>  以往被認(rèn)為是多基因病的一些疾病,一部分被證明是遺傳異質(zhì)性所致,即受單個(gè)主基因決定,如癲癇,先天性心臟病和先天性巨結(jié)腸等。</p>&l

7、t;p><b>  三、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查</b></p><p>  細(xì)胞遺傳學(xué)檢查染色體檢查或核型分析,是輔助診斷和對(duì)染色體病確診的主要方法。隨著顯帶技術(shù)的應(yīng)用,特別是高分辨染色體顯帶技術(shù)的發(fā)展,能夠更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和確定更多的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常,并發(fā)現(xiàn)新的微小畸變綜合征。利用染色體顯帶技術(shù),可以對(duì)許多疾病在染色體水平找到原發(fā)性改變,如腫瘤,發(fā)育缺陷、心血管疾病等,把疾病相關(guān)基因確定在一

8、個(gè)較小的范圍內(nèi)。</p><p>  染色體原位雜交是應(yīng)用標(biāo)記的DNA片段(探針)與玻片標(biāo)本上的細(xì)胞、染色體,以及間期的DNA或RNA雜交,研究核酸片段的位置、相互關(guān)系的技術(shù)。一般用生物素、地高辛等標(biāo)記探針,原位雜交后,用熒光染料標(biāo)記的生物素親和蛋白、抗親和蛋白的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)和雜交信號(hào)放大,使探針雜交的區(qū)域發(fā)出熒光,這種原位雜交稱熒光原位雜交(FISH),靈敏度高,特異性強(qiáng),可以檢測(cè)染色體微小結(jié)構(gòu)異常,也可應(yīng)

9、用在基因定位和基因制圖等領(lǐng)域。另外還有雙色FISH、多色FISH和染色體涂染等方法,大大提高了染色體畸變的檢出率和準(zhǔn)確性。</p><p>  染色體檢查標(biāo)本主要有外周血,羊水中胎兒脫落細(xì)胞和胎兒的臍帶血,病人的骨髓、胸腹水、手術(shù)切除的病理組織,培養(yǎng)細(xì)胞等。</p><p>  染色體檢查適應(yīng)癥包括:明顯智力發(fā)育不全者;生長(zhǎng)遲緩或伴有其他先天畸形者;夫妻之一有染色體異常,如平衡異位,嵌合體

10、等;家族中已有染色體異?;蛳忍旎蔚膫€(gè)體;多發(fā)性流產(chǎn)婦女及其丈夫;原發(fā)性閉經(jīng)和女性不育癥;無(wú)精子癥和不育的男性;兩性畸形者;疑為先天愚型的患兒及其父母;原因不明的智力低下并伴有大耳、大睪丸和多動(dòng)癥者;35歲以上的高齡孕婦。</p><p><b>  四、生化檢查</b></p><p>  生化檢查是遺傳病診斷的重要輔助手段,主要是對(duì)由于基因突變所引起的酶和蛋白質(zhì)的

11、定量和定性分析,對(duì)單基因病和先天性代謝病進(jìn)行診斷,包括一般的臨床生化檢驗(yàn)和針對(duì)遺傳病的特異檢查。</p><p>  目前已知的多種遺傳性代謝病中,大多數(shù)為酶缺陷??捎捎诨蛲蛔?、基因缺失、基因表達(dá)異?;蚍g后加工修飾缺陷所致。目前臨床主要對(duì)酶活性和代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),以血液和尿液為主要檢材,有的可以制成濾紙片和通過(guò)顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè),隨著對(duì)遺傳病發(fā)病機(jī)理認(rèn)識(shí)的深入和檢測(cè)方法的改進(jìn),檢測(cè)將更加簡(jiǎn)便、快捷。</p

12、><p>  第二節(jié) 出生前診斷</p><p>  出生前診斷或稱產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)是采用羊膜穿刺術(shù)或絨毛取樣等技術(shù),對(duì)羊水、羊水細(xì)胞和絨毛進(jìn)行遺傳學(xué)檢驗(yàn),對(duì)胎兒的染色體、基因進(jìn)行分析診斷,是預(yù)防遺傳病患兒出生的有效手段,越來(lái)越廣泛的被應(yīng)用。</p><p><b>  一、出生前診斷對(duì)象</b></p>

13、;<p>  根據(jù)遺傳病的危害程度和發(fā)病率,可將出生前診斷的對(duì)象排列如下:①夫婦之一有染色體畸變,特別是平衡易位攜帶者,或者夫婦染色體正常,但生育過(guò)染色體病患兒的孕婦;②35歲以上的孕婦;③夫婦之一有開(kāi)放性神經(jīng)管畸形,或生育過(guò)這種畸形患兒的孕婦;④夫婦之一有先天性代謝缺陷,或生育過(guò)這種患兒的孕婦;⑤X連鎖遺傳病致病基因攜帶者孕婦;⑥有習(xí)慣性流產(chǎn)史的孕婦;⑦羊水過(guò)多的孕婦;⑧夫婦之一有致畸因素接觸史的孕婦;⑨有遺傳病家族史,

14、又系近親結(jié)婚的孕婦。但應(yīng)當(dāng)注意,已出現(xiàn)先兆流產(chǎn)、妊娠時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、有出血傾向者的孕婦不宜做產(chǎn)前診斷。</p><p>  二、出生前診斷的方法</p><p><b> ?。ㄒ唬〣超 </b></p><p>  B超是一種安全無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法,能夠詳細(xì)檢查胎兒的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu),使許多遺傳性疾病得到早期診斷??梢栽\斷的疾病有,神經(jīng)管缺陷、腦積水

15、、無(wú)腦畸形;唇裂、腭裂,頸部淋巴管腫瘤;先天性心臟病,支氣管、肺發(fā)育異常、胸腔積液;其他的異常,如先天性單側(cè)腎缺如,先天性幽門(mén)狹窄、先天性巨結(jié)腸等。</p><p><b> ?。ǘ┭蚰ご┐?lt;/b></p><p>  羊膜穿刺是在B超的監(jiān)視下,用消毒的注射器抽取胎兒羊水(圖18-1)??梢詫?duì)抽取的羊水及其中的胎兒脫落細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),分析染色體,以及生化和基因的檢

16、測(cè)。如羊水中甲胎蛋白濃度過(guò)高時(shí),提示胎兒可能有無(wú)腦、開(kāi)放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和腦積水等異常。羊膜穿刺一般在妊娠16~20周進(jìn)行,流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小。</p><p>  圖18-1 羊膜穿刺示意圖</p><p><b> ?。ㄈ┙q毛取樣法</b></p><p>  絨毛取樣一般在妊娠7~9周進(jìn)行,是妊娠早期診斷方法。也是在B超監(jiān)視下,

17、用特制的取樣器,從陰道經(jīng)宮頸進(jìn)入子宮,沿子宮壁到達(dá)取樣部位,用內(nèi)管吸取絨毛(圖18-2)。絨毛取樣的優(yōu)點(diǎn)是檢查時(shí)間早,需要作出選擇性流產(chǎn)時(shí),給孕婦帶來(lái)的損傷和痛苦較小。缺點(diǎn)是經(jīng)子宮頸取樣標(biāo)本容易被污染,胎兒和母體感染和操作不便,引起流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)是羊膜穿刺的兩倍。</p><p>  羊膜穿刺法和絨毛取樣可用來(lái)診斷染色體病,遺傳代謝病,胎兒性別鑒定,所有可用胚胎或胎兒DNA檢測(cè)的疾病,另外,開(kāi)放性神經(jīng)管缺陷只能采用羊

18、膜穿刺術(shù)診斷。</p><p>  圖18-2 絨毛取樣法示意圖</p><p><b> ?。ㄋ模┠殠Т┐绦g(shù)</b></p><p>  臍帶穿刺術(shù)是在B超的監(jiān)視下,用細(xì)針經(jīng)腹壁、子宮進(jìn)入胎兒臍帶抽取胎兒血液。本方法取樣最好在妊娠18周,常用于因錯(cuò)過(guò)絨毛取樣或羊膜穿刺最佳時(shí)機(jī)或羊水檢查失敗的補(bǔ)救措施,還可以檢測(cè)胎兒的血液系統(tǒng)疾病,先天性免疫缺

19、陷,某些單基因病。</p><p><b> ?。ㄎ澹┨虹R檢查</b></p><p>  又稱羊膜腔鏡或?qū)m腔鏡檢查,它可在進(jìn)入羊膜腔后,直接觀察胎兒的外形、性別和發(fā)育狀況,是否有畸形,還可以同時(shí)抽取羊水或胎血進(jìn)行檢查,或進(jìn)行宮內(nèi)治療。因此,理論上這是一種最理想的方法。但由于操作困難,容易引起多種并發(fā)癥,目前還不能被廣泛采用。胎兒鏡檢查的最佳時(shí)間是妊娠18~20周,

20、可以診斷大皰性表皮松懈癥及某些皮膚病。</p><p>  (六)分離孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞</p><p>  目前用于出生前診斷材料的獲得對(duì)于胎兒和母體都是創(chuàng)傷性的,存在流產(chǎn)和感染等風(fēng)險(xiǎn)。從20世紀(jì)90年代末,開(kāi)始探索一種無(wú)創(chuàng)傷性的出生前診斷方法。利用妊娠期少量胎兒細(xì)胞可以通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入母體血液中,采用流式細(xì)胞儀分離技術(shù),磁激活細(xì)胞分選技術(shù),免疫磁珠法,顯微操作分選法,分離胎兒細(xì)胞。用這

21、些方法富集的胎兒細(xì)胞很少,需要用高靈敏的技術(shù)方法進(jìn)行下一步分析檢測(cè),目前常用的方法是PCR。</p><p><b> ?。ㄆ撸┲踩肭霸\斷</b></p><p>  隨著人工受精,試管嬰兒和胚胎移植技術(shù)的開(kāi)展,以及單個(gè)細(xì)胞基因診斷技術(shù)的應(yīng)用,目前正探索在胚胎植入前診斷(pre-implantation diagnosisi)。在受精后6天胚胎著床前,通過(guò)顯微操作技術(shù)

22、取出一個(gè)細(xì)胞,應(yīng)用PCR,F(xiàn)ISH等技術(shù)進(jìn)行特定基因和染色體畸變的檢測(cè),將人類的遺傳缺陷掌控在最早階段,這是遺傳病產(chǎn)前診斷的重大突破。</p><p><b>  第三節(jié) 基因診斷</b></p><p>  利用分子生物學(xué)的技術(shù),檢測(cè)體內(nèi)DNA或RNA結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平變化,從而對(duì)疾病做出診斷的方法,稱為基因診斷(gene diagnosis),通常又稱為分子診斷(mo

23、lecular diagnosis)?;蛟\斷始于1978年,應(yīng)用限制性酶切長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)檢測(cè)胎兒鐮狀細(xì)胞貧血癥。 </p><p>  基因診斷技術(shù)已逐步從實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)入臨床應(yīng)用,不僅適用于遺傳性疾病,而且已擴(kuò)展到一些感染性疾病、腫瘤的診斷。</p><p>  基因診斷具有如下特點(diǎn):以特定基因?yàn)槟繕?biāo),檢測(cè)基因的變化,特異性性強(qiáng);采用分子雜交技術(shù)和PCR技術(shù)具有信號(hào)放大作用,用

24、微量樣品即可進(jìn)行診斷,靈敏度高;在疾病尚無(wú)出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前,胎兒出生前的產(chǎn)前診斷,以及特定人群的篩查等,應(yīng)用廣泛;檢測(cè)樣品獲得便利,不受個(gè)體發(fā)育階段性和基因表達(dá)組織特異性的限制。 </p><p>  需要說(shuō)明的是,由于基因突變的類型多種多樣,除了缺失、倒位、點(diǎn)突變、動(dòng)態(tài)突變可以進(jìn)行基因的檢測(cè)外,大多數(shù)基因突變的分析復(fù)雜而繁瑣,有一定的難度。</p><p>  一、基因診斷的主要技術(shù)方法&

25、lt;/p><p>  基因診斷主要采用核酸分子雜交、PCR和DNA序列測(cè)定等技術(shù)。</p><p><b> ?。ㄒ唬┖怂岱肿与s交</b></p><p>  核酸雜交技術(shù)是在基因診斷中,用于檢測(cè)樣品中是否存在相應(yīng)的基因以及相應(yīng)基因表達(dá)狀態(tài)等等。其中Southern印跡法主要用于基因組DNA的分析,Northern印跡法用于檢測(cè)樣品中RNA的種類

26、和含量。</p><p>  1. 斑點(diǎn)印跡雜交 把待檢測(cè)的核酸樣品點(diǎn)在NC膜上,變性后與標(biāo)記的探針進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),經(jīng)過(guò)顯色和顯影后檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度,與對(duì)照樣品比較后確定所測(cè)核酸量的高低。根據(jù)NC膜上所點(diǎn)核酸樣品的種類不同,分為DNA dot blotting和 RNA dot blotting。點(diǎn)樣方式如采用狹縫點(diǎn)樣器點(diǎn)樣,得到的線狀雜交信號(hào),稱狹線印跡法。</p><p>  2.

27、 原位雜交 把組織或細(xì)胞樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理,用探針與核酸進(jìn)行雜交。這種方法不需要提取核酸,可以確定被檢核酸在組織或細(xì)胞,以及中期染色體中的定位,具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。</p><p>  3. PCR-ASO ASO為等位基因特異性寡核苷酸雜交法(allele-specific oligonucleotide,ASO)的簡(jiǎn)稱,是基于核酸雜交的一種方法。根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的堿基序列,設(shè)計(jì)和制備與野生型或

28、突變型基因序列互補(bǔ)的兩種探針,分別與被檢測(cè)者樣品中的DNA分子進(jìn)行雜交,根據(jù)樣品與兩種探針雜交信號(hào)的強(qiáng)弱,確定是否存在基因突變,判斷被檢者是突變基因的純合體或雜合體(圖18-3)。</p><p>  圖18-3 ASO探針雜交原理示意圖</p><p>  4.基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展十分迅速的大規(guī)模、高通量分子檢測(cè)技術(shù)。基本過(guò)程是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針

29、,有規(guī)律地排列固定于支持物上,如玻片、硅片或尼龍膜等,形成矩陣點(diǎn)?,F(xiàn)在的技術(shù)可以做到在1cm2上排列成千上萬(wàn)個(gè)“點(diǎn)”。樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子,然后與待測(cè)樣本進(jìn)行雜交反應(yīng),再通過(guò)激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行掃描,獲取信息,電腦系統(tǒng)分析處理所得資料,對(duì)上千種甚至更多基因的表達(dá)水平、突變和多態(tài)性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。</p><p>  基因芯片可以進(jìn)行微量化、大規(guī)模、并行化

30、、高度自動(dòng)化地處理有價(jià)值的生物樣品,精細(xì)地研究各種狀態(tài)下分子結(jié)構(gòu)變異,了解組織細(xì)胞基因表達(dá)情況。既可檢測(cè)基因的多態(tài)性,又能檢測(cè)基因突變,特別適用于多個(gè)基因、多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)。這一技術(shù)目前處于發(fā)展和優(yōu)化階段,已經(jīng)有多種針對(duì)遺傳性疾病、腫瘤檢測(cè)的基因芯片用于臨床診斷。</p><p>  (二)其它常用的技術(shù) </p><p>  1. PCR-RFLP 將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)與RFL

31、P方法結(jié)合的一種檢測(cè)技術(shù)。由于DNA序列的差異,造成了內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化,或是新酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生;或是原酶切位點(diǎn)的消失等。通過(guò)酶切后電泳圖譜的判斷,確定檢測(cè)結(jié)果。該方法包括①PCR:利用一對(duì)或數(shù)對(duì)特異性引物,將目標(biāo)DNA擴(kuò)增;②酶切:利用某些限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,如PCR產(chǎn)物中含有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)序列,DNA鏈則被切開(kāi);③利用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠分離酶切后的PCR產(chǎn)物,根據(jù)電泳圖譜判斷結(jié)果。</p><p>

32、;  如果某DNA序列已經(jīng)全部確定,則可以通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)特異性PCR引物;擴(kuò)增DNA片段和進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,該方法簡(jiǎn)便易行,精確度也很高。但是該方法也有一定的局限性,如果多態(tài)性位點(diǎn)的DNA序列沒(méi)有相應(yīng)的內(nèi)切酶,則該方法不適用。</p><p>  2. PCR-SSCP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP),是一種檢測(cè)核酸序列中點(diǎn)突變的技

33、術(shù)。當(dāng)雙鏈DNA變性為兩條單鏈后,會(huì)在中性條件下形成各自特定的空間構(gòu)象,因而在電泳時(shí)將在不同的位置上出現(xiàn)不同的電泳條帶。如果DNA序列發(fā)生改變,甚至僅有一個(gè)堿基變化時(shí),空間構(gòu)象有可能發(fā)生改變,電泳時(shí)表現(xiàn)出不同的遷移率,被檢DNA電泳條帶與已知序列的對(duì)照DNA電泳條帶不一致,出現(xiàn)新生條帶時(shí),表明有突變存在(圖18-4)。該方法與PCR聯(lián)合應(yīng)用,因此稱PCR-SSCP,主要用于突變分子的初步篩查。</p><p> 

34、 圖18-4 SSCP原理示意圖</p><p>  3. RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR以mRNA為模板合成cDNA,再進(jìn)行PCR,用于基因表達(dá)水平的檢測(cè)和分析。</p><p>  4. Western 印跡技術(shù) Western 印跡技術(shù)是檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的方法,可用于某種與遺傳病相關(guān)的蛋白質(zhì)定性定量分析。如假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)患者基因缺陷使肌細(xì)胞的增強(qiáng)蛋白(dystrop

35、hin)合成異常,采用Western 印跡法檢測(cè)患者增強(qiáng)蛋白,進(jìn)行診斷。</p><p>  二、基因診斷技術(shù)的應(yīng)用</p><p> ?。ㄒ唬┗蛟\斷在遺傳病中的應(yīng)用</p><p>  1.鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷 鐮狀細(xì)胞貧血癥的基因突變發(fā)生在珠蛋白基因內(nèi)部,可以用限制性內(nèi)切酶MstⅡ進(jìn)行檢測(cè)。基于編碼珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變?yōu)镚TG,改變了限制性內(nèi)切酶

36、MstⅡ的酶切位點(diǎn)。當(dāng)酶切正常人DNA和患者DNA后再用標(biāo)記的珠蛋白基因?yàn)樘结樧鱏outhern雜交時(shí),就會(huì)出現(xiàn)不同的DNA條帶。限制性內(nèi)切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG(其中N是任何一種核苷酸),切割正常DNA產(chǎn)生1.15kb DNA片段;若切割患者DNA時(shí),形成1.35kb 珠蛋白的DNA片段,雜合體則形成1.15,1.35兩個(gè)片段(圖11-7)。</p><p>  2.血友病A的基因診斷 血友病A是

37、X連鎖隱性遺傳病,由于遺傳性凝血障礙所致的出血性疾病。該病是凝血因子Ⅷ(FactorⅧ,F(xiàn)Ⅷ)基因的缺陷,其中大范圍的基因重排(如缺失、插入和重復(fù))只占5%,主要突變類型為堿基取代或少數(shù)堿基的缺失和插入,這些突變產(chǎn)物可能是不完整的、無(wú)活性的或不穩(wěn)定的因子Ⅷ肽鏈,導(dǎo)致臨床癥狀輕重不一。采用基因診斷方法可以檢出有部分基因缺失的患者和女性攜帶者,可進(jìn)行產(chǎn)前檢查。對(duì)該基因的產(chǎn)前診斷可以通過(guò)RFLP連鎖分析進(jìn)行,在基因的內(nèi)側(cè)及旁側(cè)有多組RFLP位

38、點(diǎn)可供基因診斷。目前多采用PCR技術(shù)與RFLP相結(jié)合的方法,先用PCR技術(shù)將包含突變DNA的片段擴(kuò)增出來(lái),然后用識(shí)別該位點(diǎn)的限制酶來(lái)酶切,電泳后直接檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的狀態(tài)。</p><p>  3. 地中海貧血的基因診斷 地中海貧血是由于基因的缺失造成的。鏈?zhǔn)怯蓛蓪?duì)基因控制的,如果在一條16號(hào)染色體上的2個(gè)基因都缺失,稱為0地貧;如果一條16號(hào)染色體上的2個(gè)基因缺失一個(gè),稱為+地貧,這兩種地貧基因可以組合引起不同

39、的綜合征。在基因的兩端設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增后的片段電泳,可以檢測(cè)缺失突變,確定被檢測(cè)者的基因型,對(duì)可疑的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。</p><p>  (二)基因診斷在腫瘤中的應(yīng)用</p><p>  腫瘤發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟過(guò)程,涉及多個(gè)癌基因的結(jié)構(gòu)改變和表達(dá)異常,如抑癌基因的缺失和突變等?;蛟\斷除了用于腫瘤的早期診斷外,還可以對(duì)腫瘤進(jìn)行腫瘤的臨床分類、預(yù)后,對(duì)腫瘤高危人群的篩選,指導(dǎo)個(gè)體

40、化治療和預(yù)防。</p><p>  1. 肺癌 近年來(lái)對(duì)肺癌的細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明,肺癌發(fā)生時(shí)常涉及1,2,3,5,6,9,11,13,17號(hào)染色體的缺失,易位,ras 、myc、 erb和 src癌基因的擴(kuò)增、突變,以及抑癌基因Rb 、p53的突變或缺失,應(yīng)用PCR-ASO,PCR-SSCP,測(cè)序,以及FISH,可以檢測(cè)其基因突變或缺失。肺癌患者常存在ras 、myc、 erb和 src癌基因的過(guò)表達(dá),因此可采

41、用Northern印跡方法進(jìn)行RNA檢測(cè)與分析,在基因水平診斷肺癌。</p><p>  2. 乳腺癌 乳腺癌是女性最常見(jiàn)腫瘤之一,癌基因nue與乳腺癌的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān),表達(dá)產(chǎn)物為表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣受體,屬于受體型酪氨酸蛋白激酶(TPK)家族成員。有Nue基因擴(kuò)增的患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高,可作為乳腺癌預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。采用Southern印跡法,可以檢測(cè)Nue基因的拷貝數(shù);Northern印跡方法檢測(cè)N

42、ue基因表達(dá)水平,進(jìn)行定量分析。 </p><p>  3. 大腸癌 在腸癌癌變的過(guò)程中存在抑癌基因FAP(family adenomatous polyposis)、DCC、p53基因的丟失,p53基因的突變;癌基因K-ras的點(diǎn)突變、C-myc的過(guò)量表達(dá)等現(xiàn)象。</p><p>  ras基因突變的檢測(cè)可采用PCR-ASO方法進(jìn)行,已知ras基因突變的熱點(diǎn)在12、13及61密碼子,可

43、人工合成位于待測(cè)點(diǎn)兩側(cè)的引物,分別擴(kuò)增含12、13及61位點(diǎn)的基因片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合在NC膜上分別與相應(yīng)的堿基突變特異性寡核苷酸探針雜交,檢測(cè)突變類型。還可以采用PCR-SSCP方法,對(duì)ras基因突變進(jìn)行初篩,再通過(guò)DNA測(cè)序檢測(cè)點(diǎn)突變,簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。</p><p>  p53基因的缺失、突變、失活是許多腫瘤發(fā)生的原因,這些腫瘤包括成骨肉瘤、肺癌、結(jié)(直)腸癌、神經(jīng)纖維肉瘤。腦瘤、乳腺癌等。該基因的突變可引起蛋

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