煙草花葉病毒弱毒疫苗的研制及其分子生物學(xué).pdf

1、福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文煙草花葉病毒弱毒疫苗的研制及其分子生物學(xué)姓名：邵碧英申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：林奇英謝聯(lián)輝2001.5.1福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文接收號(hào)分別為：AF395127、AF395128、AF395129)，結(jié)果表明，強(qiáng)、弱毒株基因組均為6395個(gè)核苷酸，具有4個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別編碼126kDa蛋I芻(693419nt1116aa)和183kDa通讀蛋白(694919nt，1616aa)、運(yùn)動(dòng)

2、蛋白(49035709nt269aa)、外殼蛋白(5712619Int，159aa)。5’端非編碼區(qū)(NR)為68nt(168m)，通讀蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白基因有17個(gè)堿基重疊，運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白基因間隔區(qū)為2nt(5710571Int)，3’端NR區(qū)為204nt(61926395nt)。TMVW和TMVU1相比，基因組同源率達(dá)到98％，TMvw為普通株系。TMV017、TlvlV152基因組核苷酸發(fā)生變異的部位主要在126／183kDa蛋白

3、ORF。和1NⅣw相比，TMv017僅在126kDa蛋白ORF中有18個(gè)堿基發(fā)生變異，10個(gè)引起氨基酸的變異；而TMV一152在126／183kD蛋白ORF中有16個(gè)堿基發(fā)生變異，其中有11個(gè)引起氨基酸的變異。TMV017和TMV152有11個(gè)共同變異的堿基，其中8個(gè)引起氨基酸的變異。TMV152在MPORF中有1個(gè)堿基引起氨基酸的變異。其它區(qū)域，三者完全相同。首次嘗試將弱毒株的缺失復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)化煙草。構(gòu)建了含TMVW、TMV017各2

4、個(gè)126kDa蛋白ORF的部分片段，E1E2(8732813nt)、R1E2(692813nt)的植物表達(dá)載體。經(jīng)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草。再生植株總DNA的Southern點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果初步表明，4個(gè)片段均己整合到煙草基因組中。再生植株總RNA的RTPCRSouthern點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果初步表明，4個(gè)片段均有轉(zhuǎn)錄。用含ndVWE1E2的重組克隆和載體pGEX2T，構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋111(94kDa)，制各了抗血