斯氏艾美爾球蟲MIC-5與兔IL-6融合基因重組質粒的構建.pdf

1、兔球蟲病是由艾美爾科的多種球蟲所引起的一種原蟲性疾病，在我國很多地區(qū)感染十分普遍，以1～3月齡的幼兔感染率最高，可達100％，死亡率在70％左右，臨床上以腹瀉、生長緩慢、消瘦為主要特征，給養(yǎng)兔業(yè)帶來了嚴重的危害。病原學調查發(fā)現(xiàn)，斯氏艾美爾球蟲蟲(E．stiedae)能引起嚴重的肝球蟲病，是兔球蟲中致病力最強、危害最大的一種球蟲。目前，控制兔球蟲病主要采用的是化學藥物方法，但隨著化學藥物殘留問題日益突出和耐藥蟲株的不斷出現(xiàn)，使得越來越多的

2、學者希望尋求免疫學方法進行疫苗防控。同時，國內外一些學者用分離的多種兔球蟲蟲株研制的兔球蟲強毒活蟲苗，通過免疫試驗表明這種球蟲活蟲苗可誘導機體產生一定的免疫力，但這種強毒活蟲苗的接種會引起病原的大量擴散，并且由于兔球蟲種類繁多，若按常規(guī)方法研制廣譜的多價兔球蟲疫苗也十分困難。隨著分子生物學技術的發(fā)展，核酸疫苗日益成為寄生蟲病防治的新途徑。核酸疫苗具備操作方法簡便，能同時誘導機體產生高水平保護性的體液和細胞免疫力，且安全、持效，有抗各種病

3、原體感染及抗腫瘤的廣闊應用前景等優(yōu)點，因此，開發(fā)有效的分子佐劑、DNA運輸載體等，來提高兔球蟲核酸疫苗的免疫效果，并增強其安全性具有重要意義。 本試驗對E．stiedae孢子化卵囊抗原候選基因MIC-5基因進行了克隆與表達，并對兔IL-6基因進行了克隆、序列分析，構建了Es MIC-5基因與兔IL-6基因的融合基因，并將該融合基因亞克降到原核表達載體PGEX—KG與真核表達載體pCDNA3.1(一)中，構建出PGEX—MIC-5

4、-IL-6原核表達質粒和pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6真核表達質粒，最后將真核表達質粒免疫小鼠，以觀察兔IL-6基因對Es MIC-5基因核酸疫苗的免疫增強作用。 1重組質粒pCDNA3.1(—)—Es MIC-5的構建 通過飽和食鹽水漂浮法提純E．stiedae，并培養(yǎng)卵囊至孢子化。將保存的E．stiedae孢子化卵囊，加適量次氯酸鈉溶液處理，收集卵囊沉淀，將提純的E．stiedae吸入到用DEPC處理過

5、的滅菌組織勻漿器內研磨30min，至使80％以上的孢子化卵囊被研破，后按Trizol試劑說明書方法提取其總RNA，經RT—PCR擴增出一條約1100bp的片段，將此基因片段插入同樣酶切位點的原核表達載體PGEX—KG和真核表達載體pCDNA3.1(—)中，經酶切鑒定、PCR擴增鑒定，表明Es MIC-5基因已連接到原核表達載體PGEX—KG和真核表達載體pCDNA3.1(—)中。并將原核表達質粒轉化到大腸桿菌BL21中，于37℃IPTG

6、誘導培養(yǎng)獲得表達，SDS—PAGE分析顯示，表達的Es MIC-5蛋白的分子量約為56Ku。 2．兔IL-6基因的克隆與序列分析 根據已公布的的歐洲兔IL-6基因序列設計特異性引物，以兔脾臟中的總RNA為模板應用兩步法RT—PCR擴增兔IL-6基因，并經酶切鑒定及序列測序，該兔IL-6基因的開放閱讀框為726bp。與同類歐洲兔、中國白兔IL-6基因的同源性為100％，與不同物種的水牛、野豬、雞、norway大鼠、小鼠、黃

7、牛、豬、馬的IL-6基因序列的同源性分別為：60.4％、64.3％、42.7％、54.3％、53.9％、61.2％、64.5％、65.4％，表明不同物種之間IL-6基因存在一定的種屬差異性。 3 MIC-5-IL-6融合基因重組質粒的構建 根據已報道的兔斯氏艾美爾球蟲微線蛋白5(Es MIC-5)的核苷酸序列和兔白介素6基因序列另設計特異性引物，且在Es MIC-5基因引物上游引入EcoRⅠ位點、下游引入SalⅠ位點。以

8、EsMIC-5的總RNA為模板RT—PCR擴增MIC-5基因，并將其克隆到pMD18—T中。再擴增上游帶有SalⅠ位點、下游帶有HindⅢ位點的兔IL-6，同時將Es MIC-5插入到含有兔IL-6基因的質粒pMD18—T—IL—6ˊ中，使兩個基因首尾相連，且Es MIC-5基因不含終止密碼子，兔IL-6基因不含起始密碼子。最后將融合基因片段定向克隆到原核表達載體pGEX—KG和真核表達載體pCDNA3.1(—)上，構建成pGEX—MI

9、C-5-IL-6重組質粒和pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6重組質粒。通過雙酶切鑒定，證明融合基因已克隆于原核表達和真核表達載體中。并將原核表達質粒轉化到大腸桿菌BL21中，于37℃ IPTG誘導培養(yǎng)獲得表達。SDS—PAGE分析顯示，表達的PGEX—MIC-5-IL-6融合蛋白分子量約為85Ku。 將試驗小鼠隨機分成4組，每組8只，分別為：pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6核酸疫苗組(Ⅰ組)、pCDNA3.

10、1(—)—MIC-5核酸免疫組(Ⅱ組)、空載體pCDNA3.1(—)組(Ⅲ組)、空白對照組(Ⅳ組)。每組肌肉注射小白鼠100ug/只，間隔15d，進行三次免疫。Ⅳ空白對照組按相同程序注射滅菌生理鹽水。在首免與二免后15天，分別進行尾靜脈采血；第3次免疫一周后進行眼眶采血，分離血清，通過ELISA檢測免疫小鼠外周血IL-2、INF—γ結果為：一免和二免，pCDNA3.1(—)—MIC-5-IL-6核酸疫苗免疫組(Ⅰ組)IL-2、IFN—γ