神經(jīng)干細胞對缺血性卒中的保護機制研究.pdf

1、腦卒中主要發(fā)生在老年人群中，是老年人群致殘的重要原因之一，以腦梗死為主。隨著我國人口進入老齡化時代，腦梗死患病率逐年升高，嚴重降低了患者的生存質(zhì)量和平均壽命，嚴重危害老年人的身體健康，給國民經(jīng)濟帶來沉重的負擔。目前臨床上傳統(tǒng)抗凝、溶栓、神經(jīng)保護以及后期的康復等治療效果有限，大部分腦卒中患者后期仍留下各種偏癱、失語等不同程度的經(jīng)功能障礙后遺癥。因此，尋找新的治療方法促進缺血性腦血管病患者神經(jīng)功能的恢復已成為當今研究的重點[1]，在過去的四

2、十年里，腦卒中發(fā)病率在發(fā)達國家降低了43％，而在發(fā)展中國家卻增長了100％，發(fā)生于這些國家的腦卒中死亡數(shù)約占腦卒中死亡總數(shù)的87％[2]。若沒有有效干預措施，至2030年全球腦卒中死亡人數(shù)將增加至780萬[3]。
　　腦卒中患者中87％是缺血性腦梗死[4]。多種疾病均可能導致缺血性卒中，而其最重要的病因包括大動脈粥樣硬化（血管），心源性腦栓塞，腦小血管病（微血管病變）。不太常見的病因是頸部動脈夾層動脈瘤、腦血管炎、凝血功能障礙性疾

3、病、血液病等。即使在完成相關診斷檢查仍有部分缺血性腦卒中患者無法明確病因。對于急性缺血性腦梗死，F(xiàn)DA只認證了早期溶栓作為治療手段。但由于時間窗的限制，95％以上的患者無法得到溶栓治療[5]。因此，探索新的、能讓更多患者受益的缺血性卒中治療策略具有極其重要的現(xiàn)實意義。
　　近年來，神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，NSCs)在腦梗死治療中的應用研究，為解決這一難題提供了新的思路和方法。國內(nèi)外已有相關研究證實了NSCS

4、s具有顯著的神經(jīng)保護作用[6，7]。
　　1.在急性腦梗死的研究中，NSCs對于血管內(nèi)皮細胞的保護作用尚不明確。腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)不僅僅是血管腔的內(nèi)襯，還能分泌活性物質(zhì)影響神經(jīng)元的生存。我們針對NSCs能否有效修復缺血損傷的BMECs開展了進一步研究。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)NSCs可以通過直接或間接接觸的方式保護缺血損傷的內(nèi)皮細胞:在前期實驗中，我們成功分離和培養(yǎng)了NSCs和BMECs;為了進一步模擬缺血損傷中內(nèi)皮細

5、胞所處的病理生理條件，我們對BMEC實施了缺糖缺氧/復糖復氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)的類缺血再灌注損傷處理，并建立了這兩種細胞的共培養(yǎng)模型;證實了NSCs能有效保護和修復OGD-BMECs。那么，NSCs是通過什么機制來發(fā)揮這種保護作用的呢？早期的研究認為干細胞分化和細胞融合是修復的可能機制，但是當前更多的研究對以上兩種觀點提出了置疑。研究發(fā)現(xiàn)，用NSCs處理中動脈栓塞(middle cerebr

6、al artery occlusion，MCAO)鼠模型，其功能評分得到很大改善，但GFP標記顯示能夠真正到達病灶分化成神經(jīng)元的NSCs數(shù)量非常有限[8]。這些外源性NSCSs來源的神經(jīng)元細胞無法解釋小鼠功能評分的顯著改善。因此，促使人們探尋NSCSs的其它可能保護機制。
　　3.PI3K/Akt/GSK-3b/mTOR信號通路參與了代謝調(diào)節(jié)、細胞生長和存活等多種重要功能。
　　PI3K活性形式為一種原癌基因，多種腫瘤疾病發(fā)

7、現(xiàn)有PI3K的異常擴增和突變。在哺乳動物細胞中，基于結(jié)構(gòu)、分布及活化機制的不同，PI3K可被分為三類，Ⅰ類PI3Ks分為Ⅰa和Ⅰb兩類[9]。ⅠA類PI3K可被受體酪氨酸激酶激活，而Ⅰb類PI3K則被G蛋白偶聯(lián)受體激活。這些PI3K均是由調(diào)節(jié)亞基（如p85）和催化亞基（如P110）組成的異源二聚體。PI3K參與控制細胞的遷移和血管生成。PI3K產(chǎn)生的磷脂第二信使參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導過程中的多個步驟。PI3K可磷酸化和激活Akt，將其定位在

8、質(zhì)膜上[10]。
　　Akt是PI3K調(diào)節(jié)細胞生長和細胞遷移的主要下游靶因子。在人體內(nèi)有三種亞型:Akt1、Akt2和Akt3。PI3K產(chǎn)生的PIP3結(jié)合Akt并導致Akt的膜聚集，并通過其PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)，然后PDK1磷酸化Akt激酶結(jié)構(gòu)域[11]。為充分激活Akt，也需PDK2磷酸化AKT羧基端調(diào)節(jié)區(qū)域（AKT1在絲氨酸473位）。一旦激活，AKT就進入細胞質(zhì)和細胞核，產(chǎn)生一系列下游影響，如激

9、活CREB，抑制p27，將FOXO定位于細胞質(zhì)中，激活ptdins-3ps，影響P70和4EBP1的轉(zhuǎn)錄導致mTOR復合物的聚集和激活。mTOR調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1進而引起翻譯起始因子eIF4E的釋放。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，已有研究證明該激酶參與細胞增殖、細胞程序性死亡，胚胎發(fā)生，調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。
　　GSK-3β屬于保守絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，它的活性可以在

10、Tyr殘基被磷酸化后激活，而其活性會在Ser9殘基部位被磷酸化后抑制，多種細胞功能的調(diào)節(jié)均有GSK-3β的參與，包括基因表達、代謝、和維持細胞骨架的完整性，GSK-3β是一種細胞生長、增殖的負性調(diào)控因子[12]。
　　許多已知因素包括EGF，shh，IGF-1、胰島素和Cam等均可激活PI3K/Akt通路，而PTEN，HB9等可拮抗該通路表達[7,11,13-16]。越來越多的證據(jù)顯示，NSCSs與BMEC直接接觸共培養(yǎng)對PI3

11、K/Akt/GSK-3β/mTOR信號通路的影響可能增加了NSCs對內(nèi)皮細胞功能的調(diào)節(jié)作用[9]。研究該通路在此過程中作用機制，可望為腦卒中的合理預防、逆轉(zhuǎn)提供重要依據(jù)。本課題擬通過體內(nèi)外的缺血缺氧模型探討神經(jīng)干細胞在卒中病變中的神經(jīng)保護機制及PI3 K/Akt/GSK-3β/mTOR信號通路的影響。
　　實驗方法：
　　1.原代培養(yǎng)神經(jīng)元
　　2.不同濃度GSK-3β抑制劑TWS119不同濃度處理細胞，MTT法檢測神

12、經(jīng)元活性變化
　　3.MAP-2熒光染色后使用Image-J軟件計數(shù)神經(jīng)元突觸總長度變化
　　4.Western Blot檢測Mcl-1、Bcl-2、Bax凋亡通路相關蛋白表達變化
　　5.原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞及胎鼠培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，將BMECs置于氧糖剝奪環(huán)境中，兩種細胞使用Transwell小室進行間接共培養(yǎng)
　　6.Casepase-3凋亡相關酶活性及LDH酶活性檢測細胞損傷
　　7.Western

13、 Blot及q-rtPCR檢測PI3K/AKT/GSK-3信號通路表達變化
　　8.制作大腦中動脈栓塞模型在SD大鼠中模擬缺血性腦梗，設置假手術(shù)組，NSCs治療組，動物疾病模型組、PI3k抑制劑組進行免疫組化染色等體內(nèi)實驗
　　9.行為學及TTC染色明確腦梗模型建立
　　10.HE染色、尼氏染色觀察神經(jīng)干細胞移植后腦組織形態(tài)學改變
　　11.MAP-2、GAP-43、Sinapsin-1染色觀察神經(jīng)元、突觸重塑情

14、況
　　12.IBA-1、GFAP免疫組化觀察小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞激活情況反映免疫激活狀態(tài)
　　13.Beclin-1、LC-3免疫組化檢測自噬活性
　　14.檢測細胞、動物模型中炎癥因子表達變化
　　15.錯步實驗及黏膠移除實驗進行腦梗后行為學觀察。
　　結(jié)果：
　　1.MTT染色顯示細胞活性在氧糖剝奪環(huán)境中顯著降低，但GSK-3β抑制劑TWS119處理后神經(jīng)元活性提高
　　2.GSK-3

15、β抑制劑TWS119增加神經(jīng)元突觸總長度
　　3.GSK-3β抑制劑TWS119能增加抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2的表達，而下調(diào)促凋亡蛋白Bax
　　4.GSK-3β抑制劑TWS119可使抗炎因子IL-10表達增加，而促炎因子IL-1β，IL-6及ICAM-1下降，炎癥因子IFN-γ表達未見明顯變化
　　5.原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞及胎鼠神經(jīng)干細胞使用Transwell小室進行間接共培養(yǎng)，其PI3K/AKT/GSK

16、-3信號通路磷酸化水平增高，Casepase-3凋亡相關酶活性及LDH酶活性檢測提示細胞損傷較單純?nèi)毖Ｐ图毎M減輕
　　6.制作大腦中動脈栓塞模型在SD大鼠中模擬缺血性腦梗，設置假手術(shù)組，NSCs治療組，動物疾病模型組進行免疫組化染色等體內(nèi)實驗
　　7.大鼠行為學、TTC染色明確腦梗模型建立
　　8.HE染色、尼氏染色觀察神經(jīng)干細胞注射后腦組織核固縮、核碎裂及尼氏染色缺失等病理改變有所減輕
　　9.MAP-2、

17、GAP-43、Sinapsin-1染色觀察顯示細胞存活量在NSCs治療后明顯提高
　　10.IBA-1、GFAP免疫組化觀察NSCs能降低缺血損傷引起的炎癥反應細胞激活，自噬活性也降低
　　11.NSCs治療后，動物模型中炎癥因子L-Selectin，leptin，MCP-1及TNFα表達降低，抗炎因子TIMP-1表達升高
　　12.NSCs治療組大鼠行為學實驗中錯步數(shù)及黏膠移除所需時間均有所減少
　　13.以上

18、變化可被PI3k抑制劑LY294002部分逆轉(zhuǎn)
　　結(jié)論：
　　抑制神經(jīng)元GSK-3β對氧糖剝奪環(huán)境下的神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用，提高神經(jīng)元活性，使神經(jīng)元突觸長度變長，抑制凋亡活性。機體內(nèi)產(chǎn)生GSK-3β抑制作用的主要上游信號通路由PI3K/AKT介導，神經(jīng)干細胞能激活氧糖剝奪環(huán)境下BMECs中該通路，同時通過抗凋亡、抗炎、抑制自噬等作用促進MCAO模型鼠神經(jīng)功能恢復。這些作用部分被PI3K抑制劑LY294002所抵消，說明神經(jīng)干