鹽度和溫度對大菱鲆非特異性免疫力的影響及淡水螯蝦相關(guān)免疫因子的研究.pdf

1、本論文主要包括二部分:一為鹽度和溫度對大菱鲆非特異性免疫力的影響;二為淡水螯蝦相關(guān)免疫因子的研究。
　　 1.鹽度對大菱鲆非特異性免疫力的影響。本實(shí)驗(yàn)主要研究不同鹽度對感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)非特異性免疫力的影響。大菱鲆(平均體重25±2g)分別在不同鹽度(8、20、32和40 g/L)下飼養(yǎng)7d后注射感染鰻弧菌。在半致死濃度實(shí)驗(yàn)中,分別在每一個(gè)

2、鹽度處理組每一尾魚的背鰭基部注射0.1 ml不同濃度的鰻弧菌液(3.75×107,3.75×108和3.75×109CFU/ml),統(tǒng)計(jì)4 d半致死濃度。在非特異性免疫實(shí)驗(yàn)中,在不同鹽度處理組的每一尾魚的背鰭基部注射1.1×108CFU/ml鰻弧菌,然后分別在感染后24 h、48h和72 h取樣,測定實(shí)驗(yàn)魚血清中替代補(bǔ)體途徑活力、溶菌酶活力及頭腎吞噬活力。每一個(gè)處理組都有三個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在養(yǎng)殖鹽度為20 g/L時(shí)大菱鲆感染鰻弧菌

3、4 d半致死濃度最高(8.88±0.17),顯著高于40 g/L處理組的半致死濃度(8.04±0.04)(P＜0.05),而與其他兩個(gè)處理組沒有顯著差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)大菱鲆的替代補(bǔ)體途徑活力、溶菌酶活力以及吞噬活力均在養(yǎng)殖鹽度為20 g/L處理組時(shí)具有最高值,而在40 g/L具有最低值。除鹽度40g/L處理組(溶菌酶活力從48 h到72 h降低)外,大菱鲆感染鰻弧菌后72 h內(nèi),隨著感染時(shí)間的延長,各處理組的替代補(bǔ)體途徑活力、溶

4、菌酶活力以及吞噬活力均呈上升趨勢。這些結(jié)果表明,生活在養(yǎng)殖鹽度為20 g/L的大菱鲆具有較高的抗鰻弧菌能力。
　　 2.溫度對大菱鲆非特異性免疫力的影響。本實(shí)驗(yàn)主要研究溫度對感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)非特異性免疫力的影響。大菱鲆幼魚(平均體重25±2 g)分別在不同溫度(10、15、20和25℃)下飼養(yǎng)7d后注射感染后。在半致死濃度實(shí)驗(yàn)中,分別在每

5、一個(gè)溫度處理組每一尾魚的背鰭基部注射0.1 ml不同濃度的鰻弧菌液(3.75×107,3.75×108和3.75×109CFU/ml),統(tǒng)計(jì)4d半致死濃度。在非特異性免疫實(shí)驗(yàn)中,在不同溫度處理組的每一尾魚的背鰭基部注射5.0×107 CFU/ml鰻弧菌,然后分別在感染后24 h、48h和72 h取樣,測定實(shí)驗(yàn)魚血清中替代補(bǔ)體途徑活力、溶菌酶活力及頭腎吞噬活力。每一個(gè)處理組都有三個(gè)重復(fù)。研究結(jié)果表明,在養(yǎng)殖溫度為15℃時(shí)大菱鲆感染鰻弧菌4

6、d半致死濃度最高(8.94±0.12),并顯著高于25℃處理組的半致死濃度(7.70±0.12)(P＜0.05)。替代補(bǔ)體途徑活力、溶菌酶活力以及吞噬活力均分別在養(yǎng)殖溫度為15℃的處理組具有最高值,在25℃具有最低值。72 h之內(nèi),隨著大菱鲆感染鰻弧菌時(shí)間的延長,不同溫度處理的替代補(bǔ)體途徑活力、溶菌酶活力以及吞噬活力均呈上升趨勢。結(jié)果表明,養(yǎng)殖溫度為15℃的大菱鲆具有較高的抗鰻弧菌能力。
　　 3.淡水螯蝦(Pacifastac

7、us leniusculus)發(fā)育中期的受精卵中相關(guān)免疫基因的表達(dá)。淡水鰲蝦沒有幼蟲期,具有抱卵習(xí)性,通常產(chǎn)卵后在腹肢孵育直至小鰲蝦破殼。本實(shí)驗(yàn)主要為了明確免疫相關(guān)基因是否在胚胎發(fā)育期間表達(dá)。所研究基因根據(jù)它們的功能和作用被分為以下三類:酚氧化酶原系統(tǒng)(proPO)、抗菌肽(AMPs)以及造血作用相關(guān)的因子。并進(jìn)一步通過浸泡受精卵在高濃度的致病菌環(huán)境中檢測胚胎的免疫反應(yīng)。半定量RT-PCR分析表明:在此發(fā)育期的受精卵中,無法檢測到pro

8、PO的mRNA,而其他所有proPO系統(tǒng)中相關(guān)的基因均可表達(dá),其中血藍(lán)蛋白的表達(dá)顯著高于其他基因的表達(dá)。在抗菌肽基因的檢測中,ALF和plcrustin-1的mRNA表達(dá)水平相近,但均高于plcrustin-2的mRNA水平,而在所有抗菌肽基因中plcrustin-3的表達(dá)最高。與造血組織細(xì)胞分化和增殖相關(guān)的Astakine 1、2和Tgase的轉(zhuǎn)錄水平基本一致。因?yàn)閜roPO產(chǎn)生于血細(xì)胞中并且在甲殼類免疫反應(yīng)中具有重要作用,這表明淡水

9、螯蝦的受精卵在此發(fā)育階段沒有完整有效的免疫系統(tǒng),在保護(hù)胚胎不受細(xì)菌感染機(jī)制上,卵殼可能起到重要的屏障保護(hù)作用。
　　 4.Kazal型蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)錄本在淡水螯蝦(Pacifastacus leniusculus)不同血細(xì)胞中的表達(dá)以及序列比較分析。甲殼類的血細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的Kazal型蛋白酶抑制劑(KPI)轉(zhuǎn)錄本。在對淡水鰲蝦(Pacifastacus leniusculus)和斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)的研

10、究中發(fā)現(xiàn)在它們的血細(xì)胞中分別至少存在26和20個(gè)不同的Kazal結(jié)構(gòu)域。與其他種類的KPIs進(jìn)行序列比較發(fā)現(xiàn)這一序列的高度變異性。盡管氨基酸Pl(一個(gè)決定底物特異性的位置)會高度變化,但幾個(gè)保守位置(例如6個(gè)不變的半胱氨酸)卻存在于所有結(jié)構(gòu)域。對單只淡水鰲蝦的研究證明在個(gè)體水平上,血細(xì)胞產(chǎn)生的KPIs序列同樣存在變異性。通過半定量RT-PCR分析,在淡水鰲蝦造血組織細(xì)胞和不同類型血細(xì)胞中的4個(gè)KPI轉(zhuǎn)錄本表達(dá)分析表明部分KPI很可能參與

11、造血或是成熟血細(xì)胞釋放的過程,因?yàn)檫@些KPI只在特定血細(xì)胞或是成熟血細(xì)胞中產(chǎn)生。
　　 5.利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)淡水螯蝦properoxinectin蛋白的研究。首先通過PCR方法擴(kuò)增properoxinectin全長基因,N端融合6×His序列,定向克隆入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl中,經(jīng)核苷酸序列測定正確后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10Bac細(xì)胞,并在DH10Bac細(xì)胞內(nèi)重組pFastBacl與桿粒發(fā)生轉(zhuǎn)座篩選陽