蛋白質的化學下

1、蛋白質的化學（下）,本章主要內容第一節(jié) 蛋白質是生命的物質基礎第二節(jié) 蛋白質的化學組成第三節(jié) 蛋白質的分子結構第四節(jié) 蛋白質的結構和功能第五節(jié) 蛋白質的性質第六節(jié) 蛋白質分離純化的基本原理,第四節(jié) 蛋白質的結構與功能,一、蛋白質一級結構與功能的關系二、蛋白質的空間構象與功能的關系三、蛋白質的結構與生物進化,蛋白質復雜的組成和結構是其多種多樣生物學功能的基礎；而蛋白質獨特的性質和功能則是其結構的

2、反映。蛋白質一級結構包含了其分子的所有信息，并決定其高級結構，高級結構和其功能密切相關。,蛋白質結構與功能關系的一般原則,每一種蛋白質都具有特定的結構，也具有特定的功能。一旦結構（特別是高級結構）破壞，其功能隨之喪失。蛋白質的高級結構決定蛋白質的功能。蛋白質的一級結構決定其高級結構，因此，最終決定了蛋白質的功能。一級結構相似的蛋白質具有相似的功能。功能相似的蛋白往往能顯示它們在進化上的親緣關系，這是研究分子進化的基礎。許多疾病

3、是蛋白質三維結構異常引起，屬于構象病。（例如囊性纖維變性，鐮狀紅細胞貧血和瘋牛病）,一、蛋白質一級結構與功能的關系,一級結構決定高級結構，也決定蛋白質的功能,1、一級結構不同，生物學功能各異 實例：加壓素和催產(chǎn)素2、一級結構中“關鍵”部分相同，其功能也相同 實例：促腎上腺皮質激素（ACTH）3、蛋白質一級結構的變異與分子病 實例：血紅蛋白質異常病變?鐮刀型貧血病,1、一級結構不同，生物學功能各異

4、 實例：加壓素和催產(chǎn)素（垂體后葉分泌的九肽激素）,加壓素：促進血管收縮，升高血壓及促進腎小管對水的重吸收，抗利尿作用；催產(chǎn)素：刺激平滑肌引起子宮收縮，催產(chǎn)作用。,2、一級結構中“關鍵”部分相同，其功能也相同 實例：促腎上腺皮質激素（ACTH）,不同動物來源的ACTH，其氨基酸順序差異主要在25-33位，而1-24位的氨基酸順序相同表現(xiàn)出相同的生化功能。,1………………….24 25………33…….39

5、 活性必需部分 種屬特異性,若N端1位絲氨酸被乙?；?，活性顯著降低，僅為原活性的3.5％；若切去25-39片段仍具有全部活性。,來源 31 32 人 ser glu 豬 leu glu 牛 ser gln,3、蛋白質一級結構的變

6、異與分子病 實例：血紅蛋白質異常病變?鐮刀型貧血病,血紅蛋白共有4條多肽鏈，574個氨基酸，僅有一個氨基酸殘基發(fā)生變化，就導致這種嚴重的結果。,glu,val,一級結構“關鍵”部分的變化，其生物活性也改變 近年來應用蛋白質工程技術，如選擇性的基因突變或化學修飾等，定向改造多肽中一些“關鍵”的氨基酸，可得到自然界不存在而功能更優(yōu)的多肽或蛋白質，這對研究多肽類新藥具有重要意義。,二、蛋白質的空間構象與功能的關系,高級構象決定蛋白

7、質的功能,1 、蛋白質前體的激活與高級結構 實例：胰島素原的激活、消化酶原的激活2 、蛋白質在表現(xiàn)生物功能時，構象發(fā)生一定變化（變構效應） 實例：血紅蛋白的變構效應和輸氧功能3、蛋白質高級構象破壞，功能喪失 實例：核糖核酸酶的變性與復性,,1 、蛋白質前體的激活與高級結構 實例：胰島素原的激活,胰島素原其活性僅為胰島素活性的5-10％,實例：消化酶原的激活,蛋白質的變構現(xiàn)象 allost

8、eric effect,在生物體內，當某種物質特異地與蛋白質分子的某個部位結合，觸發(fā)該蛋白質的構象發(fā)生一定變化，從而導致其生物學功能的變化，這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變構效應。,2 、蛋白質在表現(xiàn)生物功能時，構象發(fā)生一定變化（變構效應）,1、一級結構不變化2、是調節(jié)蛋白質生物學功能普遍而有效的方式~具有四級結構的多聚體酶或蛋白質常處于某些代謝通路的關鍵部位，所以具有調節(jié)整個反應過程的作用，它們常是通過多聚體的變構作用而實現(xiàn)的。~組成蛋白

9、質的各個亞基共同控制著蛋白質分子完整的生物活性，并對信息(變構效應物)做出反應，信息與一個亞基的結合可傳遞到整個蛋白質分子，這個傳遞是通過亞基構象的改變而實現(xiàn)的。,實例：血紅蛋白的變構效應和輸氧功能,血紅蛋白的與氧氣結合前后的構象變化,血紅蛋白分子中的一個亞基結合O2后，可以導致其構象的變化，并引起其他三個亞基的構象相繼發(fā)生變化，使得其他亞基對O2的親和力突然增強。,3、蛋白質高級構象破壞，功能喪失 實例：核糖核酸酶的變性與復性

10、,三、蛋白質的結構與生物進化,一般來說，對細胞來說非常重要的蛋白質分子變化較少且慢，如細胞色素C、核糖體蛋白、泛素等。因此，細胞色素C常常用來當作研究分子進化的研究對象。,生物在長期進化和發(fā)展過程中，不斷分化出結構與功能相適應的蛋白質。因此，生物的變異不僅表現(xiàn)在生物的外部形態(tài)上，也必然要反映在蛋白質的結構上。,實例：細胞色素Ｃ,不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目,生物 與人不同的AA數(shù)目黑猩猩

11、 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、豬、羊、狗 11馬 12雞、火雞 13響尾蛇

12、 14海龜 15金槍魚 21角餃 23小蠅 25蛾 31小麥

13、 35粗早鏈孢霉 43酵母 44,,,第五節(jié) 蛋白質的性質,一、蛋白質分子的大小、形狀及分子量的測定二、蛋白質的變性與復性三、蛋白質的兩性電離與等電點四、蛋白質的膠體性質五、蛋白質的沉淀反應六、蛋白質的顏色反應 七、蛋白質的免疫學性質,一、蛋白質分子大小、形狀及分子量測定,(一)

14、蛋白質分子的大小分子量低于1萬 多肽 高于1萬 蛋白質,10000d=10kd,(二) 蛋白質的分子形狀,根據(jù)擴散系數(shù)、黏度或其他物理方法等可以推算出蛋白質的不對稱常數(shù),,≈1 分子呈球形 >1 分子呈橢球形 >>1 分子呈纖維狀,蛋白質是一類高分子化合物，其在溶液中的形狀可根據(jù)不對稱常數(shù)分為球形、橢圓形、纖維狀等。,(三) 蛋白質分子量的測定,Western bl

15、ot,二、蛋白質的變性與復性,變性,復性,變性 ：某些物理的和化學的因素使蛋白質分子的空間構象發(fā)生改變或破壞，導致其生物活性的喪失和一些理化性質的改變。,復性：蛋白質的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構象，恢復原有的理化性質和生物活性。,蛋白質變性的學說最早由我國生化學家吳憲(1931)提出，他認為天然蛋白質分子受環(huán)境因素的影響，從有規(guī)則的緊密結構變?yōu)闊o規(guī)則的松散狀態(tài)

16、，即變性作用。,變性的本質 蛋白質結構內部的次級鍵受到破壞，從而導致蛋白質分子空間構象的改變或破壞，而不涉及一級結構的改變或肽鍵的斷裂。,變性的特征 (1)生物活性的喪失(2)某些理化性質的改變 ： 溶解度；結晶能力；黏度；不對稱性；易水解,變性的因素和程度,物理因素：高溫、紫外線、X-射線、超聲波和劇烈振蕩等；化學因素：強酸、強堿、尿素、去污劑、重金屬(Hg2+、As+、Pb2+)、三氯醋酸

17、、濃乙醇等,如除去變性因素后，蛋白質構象可恢復者稱可逆變性；構象不能恢復者稱不可逆變性。,變性的應用,eg.酒精、紫外線消毒，高溫、高壓滅菌等是使細菌蛋白變性而失去活性； 中草藥有效成分的提取或其注射液的制備也常用變性的方法(加熱、濃乙醇等)除去雜蛋白； 在制備有生物活性的酶,蛋白質, 激素或其他生物制品(疫苗、抗毒素等)時，要求所需成分不變性，而不需要的雜蛋白應使其變性或沉淀除去。此時，應選用適當?shù)姆椒?/p>

18、，嚴格控制操作條件，盡量減少所需蛋白質變性。有時還可加些保護劑、抑制劑等以增強蛋白質的抗變性能力,三、蛋白質的兩性電離與等電點,蛋白質與氨基酸一樣在純水溶液和結晶狀態(tài)中都以兩性離子的形式存在，即同一分子中可帶有正負兩種電荷，羧基帶負電而氨基帶正電。,使蛋白質所帶正負電荷相等，凈電荷為零時溶液的pH，稱為蛋白質的等電點。,四、蛋白質的膠體性質,,蛋白質具有如布朗運動、光散射現(xiàn)象、不能透過半透膜以及具有吸附能力等膠體溶液的一般特征。,水化層

19、,蛋白質水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體。蛋白質形成親水膠體有兩個基本的穩(wěn)定因素：1、表面具有水化層 2、表面具有同性電荷 。,www.themegallery.com,Company Logo,蛋白質膠體性質的應用,透析法:利用蛋白質不能透過半透膜的的性質，將含有小分子雜質的蛋白質溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質被透析出，大分子蛋白質留在袋中，以達到純化蛋白質的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。鹽析法:在蛋白質溶液

20、中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質顆粒的水化層。同時又中和了蛋白質表面的電荷，從而使蛋白質顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（salting out）。 鹽溶: 加入少量中性鹽可增大蛋白質溶解度的現(xiàn)象。,五、蛋白質的沉淀反應,1. 鹽析 (高濃度中性鹽，不變性) 2. 有機溶劑沉淀 3. 加熱變性沉淀 4. 重金屬鹽沉淀 5. 生物堿試劑沉淀 (或某些酸

21、類),沉淀= or ≠ 變性？,蛋白質變性有時可表現(xiàn)為沉淀，亦可表現(xiàn)為溶解狀態(tài)；同樣，蛋白質沉淀有時可以是變性，亦可以不是變性，這取決于沉淀的方法和條件以及是否對蛋白質空間構象有無破壞而定。,六、蛋白質的顏色反應,蛋白質的顏色反應是其氨基酸一些基團以及肽鍵等與一定的試劑所產(chǎn)生的化學反應，并非是蛋白質的特異反應。,雙縮脲反應,雙縮脲反應 蛋白質在堿性溶液中可與Cu2+產(chǎn)生紫紅色反應。這是蛋白質分子中肽鍵的反應，肽鍵越多反應顏色越深。,七

22、、蛋白質的免疫學性質,凡能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答，并能與相應的抗體和(或)致敏淋巴細胞受體發(fā)生特異性結合的物質，統(tǒng)稱為抗原（antigen）。 抗原刺激機體產(chǎn)生能與相應抗原特異結合并具有免疫功能的免疫球蛋白，稱為抗體（antibody）。,近年來隨著對抗體理化性質、結構及免疫化學的深入研究，將具有抗體活性以及化學結構與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱免疫球蛋白(immunoslobulin，Ig),抗原與抗體結合所引起反應，稱

23、為免疫反應。免疫反應是人類對疾病具有抵抗力的重要標志。,各抗原分子具有許多抗原決定簇。因此，由它免疫動物所產(chǎn)生的抗血清實際上是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體(polyclonalantibodies)。用這種傳統(tǒng)的方法制備抗體，其效價不穩(wěn)定而產(chǎn)量有限，要想將這些不同抗體分離純化是極其困難的。,單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)是針對一個抗原決定簇、又是由單一的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的抗體。它是結構和特異性完全相

24、同的高純度抗體。,蛋白質免疫性質的應用 疾病的預防、診斷和治療； 免疫分析：RIA 和EIA 分離純化：親和層析,第六節(jié) 蛋白質的分離與純化的基本原理,蛋白質的提取蛋白質的分離與純化蛋白質的純度鑒定和含量測定,蛋白質的提取,材料的選擇——選擇合適的原材料組織細胞的粉碎——采用適當方法將細胞破碎目的蛋白的提取——利用緩沖液將細胞內的成分溶解出來,超聲破碎儀,手持勻漿機,,細胞裂解液,www

25、.themegallery.com,Company Logo,蛋白質的分離與純化,根據(jù)溶解度不同分離； 等電點沉淀；鹽析；低溫有機溶劑沉淀根據(jù)分子大小不同分離； 透析和超濾；分子排阻層析；密度梯度離心根據(jù)電離性質不同分離； 電泳；離子交換層析根據(jù)配基特異性不同分離 親和層析,透析(dialysis)法是利用蛋白質大分子對半透膜的不可透過性而與其他小分子物質分開。此法簡便，常用于蛋白質的脫鹽，但需時間較

26、長。,超濾法(ultrafiltration) 是利用超濾膜在一定的壓力或離心力的作用下，大分子物質被截留而小分子物質則濾過排出。 此法的優(yōu)點是可選擇性地分離所需分子量的蛋白質、超濾過程無相態(tài)變化、條件溫和、蛋白質不易變性，常用于蛋白質溶液的濃縮、脫鹽、分級純化等。,凝膠過濾 ： 簡便而有效的生化分離方法之一。其原理是利用蛋白質分子量的差異，通過具有分子篩性質的凝膠而被分離。,分子排阻層析,離子交換層析,,,

27、利用蛋白質是兩性化合物的特點對蛋白質進行分離純化。,陰離子交換介質,上樣,淋洗,洗脫,在不溶性惰性載體上共價連接正電荷基團，吸附和交換周圍環(huán)境中的陰離子(帶負電荷的蛋白)。,親和層析法 affinity chromatography,根據(jù)具有特異親和力的化合物之間能可逆結合與解離的性質建立的層析方法，稱為親和層析。,,親和基團配體,,,eg.抗原和抗體；protein A與 抗體；酶與底物/抑制劑,www.themegallery.

28、com,Company Logo,蛋白質的純度鑒定和含量測定,純度鑒定方法 層析法(HPLC) 電泳法(PAGE & SDS-PAGE) 免疫化學法(RIA & EIA),www.themegallery.com,Company Logo,蛋白質的含量測定,凱氏定氮法（Kjedahl法）福林-酚 試劑法 25~250ug/ml雙縮脲法