蛋白質(zhì)的化學(xué)下

1、蛋白質(zhì)的化學(xué)（下）,本章主要內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成第三節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)第六節(jié) 蛋白質(zhì)分離純化的基本原理,第四節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系二、蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與功能的關(guān)系三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化,蛋白質(zhì)復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)是其多種多樣生物學(xué)功能的基礎(chǔ)；而蛋白質(zhì)獨(dú)特的性質(zhì)和功能則是其結(jié)構(gòu)的

2、反映。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包含了其分子的所有信息，并決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和其功能密切相關(guān)。,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的一般原則,每一種蛋白質(zhì)都具有特定的結(jié)構(gòu)，也具有特定的功能。一旦結(jié)構(gòu)（特別是高級(jí)結(jié)構(gòu)）破壞，其功能隨之喪失。蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，因此，最終決定了蛋白質(zhì)的功能。一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的功能。功能相似的蛋白往往能顯示它們在進(jìn)化上的親緣關(guān)系，這是研究分子進(jìn)化的基礎(chǔ)。許多疾病

3、是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)異常引起，屬于構(gòu)象病。（例如囊性纖維變性，鐮狀紅細(xì)胞貧血和瘋牛?。?一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，也決定蛋白質(zhì)的功能,1、一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，生物學(xué)功能各異 實(shí)例：加壓素和催產(chǎn)素2、一級(jí)結(jié)構(gòu)中“關(guān)鍵”部分相同，其功能也相同 實(shí)例：促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）3、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病 實(shí)例：血紅蛋白質(zhì)異常病變?鐮刀型貧血病,1、一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，生物學(xué)功能各異

4、 實(shí)例：加壓素和催產(chǎn)素（垂體后葉分泌的九肽激素）,加壓素：促進(jìn)血管收縮，升高血壓及促進(jìn)腎小管對(duì)水的重吸收，抗利尿作用；催產(chǎn)素：刺激平滑肌引起子宮收縮，催產(chǎn)作用。,2、一級(jí)結(jié)構(gòu)中“關(guān)鍵”部分相同，其功能也相同 實(shí)例：促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）,不同動(dòng)物來源的ACTH，其氨基酸順序差異主要在25-33位，而1-24位的氨基酸順序相同表現(xiàn)出相同的生化功能。,1………………….24 25………33…….39

5、 活性必需部分 種屬特異性,若N端1位絲氨酸被乙?；钚燥@著降低，僅為原活性的3.5％；若切去25-39片段仍具有全部活性。,來源 31 32 人 ser glu 豬 leu glu 牛 ser gln,3、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變

6、異與分子病 實(shí)例：血紅蛋白質(zhì)異常病變?鐮刀型貧血病,血紅蛋白共有4條多肽鏈，574個(gè)氨基酸，僅有一個(gè)氨基酸殘基發(fā)生變化，就導(dǎo)致這種嚴(yán)重的結(jié)果。,glu,val,一級(jí)結(jié)構(gòu)“關(guān)鍵”部分的變化，其生物活性也改變 近年來應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如選擇性的基因突變或化學(xué)修飾等，定向改造多肽中一些“關(guān)鍵”的氨基酸，可得到自然界不存在而功能更優(yōu)的多肽或蛋白質(zhì)，這對(duì)研究多肽類新藥具有重要意義。,二、蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與功能的關(guān)系,高級(jí)構(gòu)象決定蛋白

7、質(zhì)的功能,1 、蛋白質(zhì)前體的激活與高級(jí)結(jié)構(gòu) 實(shí)例：胰島素原的激活、消化酶原的激活2 、蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生一定變化（變構(gòu)效應(yīng)） 實(shí)例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能3、蛋白質(zhì)高級(jí)構(gòu)象破壞，功能喪失 實(shí)例：核糖核酸酶的變性與復(fù)性,,1 、蛋白質(zhì)前體的激活與高級(jí)結(jié)構(gòu) 實(shí)例：胰島素原的激活,胰島素原其活性僅為胰島素活性的5-10％,實(shí)例：消化酶原的激活,蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象 allost

8、eric effect,在生物體內(nèi)，當(dāng)某種物質(zhì)特異地與蛋白質(zhì)分子的某個(gè)部位結(jié)合，觸發(fā)該蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生一定變化，從而導(dǎo)致其生物學(xué)功能的變化，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng)。,2 、蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生一定變化（變構(gòu)效應(yīng)）,1、一級(jí)結(jié)構(gòu)不變化2、是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能普遍而有效的方式~具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的多聚體酶或蛋白質(zhì)常處于某些代謝通路的關(guān)鍵部位，所以具有調(diào)節(jié)整個(gè)反應(yīng)過程的作用，它們常是通過多聚體的變構(gòu)作用而實(shí)現(xiàn)的。~組成蛋白

9、質(zhì)的各個(gè)亞基共同控制著蛋白質(zhì)分子完整的生物活性，并對(duì)信息(變構(gòu)效應(yīng)物)做出反應(yīng)，信息與一個(gè)亞基的結(jié)合可傳遞到整個(gè)蛋白質(zhì)分子，這個(gè)傳遞是通過亞基構(gòu)象的改變而實(shí)現(xiàn)的。,實(shí)例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能,血紅蛋白的與氧氣結(jié)合前后的構(gòu)象變化,血紅蛋白分子中的一個(gè)亞基結(jié)合O2后，可以導(dǎo)致其構(gòu)象的變化，并引起其他三個(gè)亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生變化，使得其他亞基對(duì)O2的親和力突然增強(qiáng)。,3、蛋白質(zhì)高級(jí)構(gòu)象破壞，功能喪失 實(shí)例：核糖核酸酶的變性與復(fù)性

10、,三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物進(jìn)化,一般來說，對(duì)細(xì)胞來說非常重要的蛋白質(zhì)分子變化較少且慢，如細(xì)胞色素C、核糖體蛋白、泛素等。因此，細(xì)胞色素C常常用來當(dāng)作研究分子進(jìn)化的研究對(duì)象。,生物在長期進(jìn)化和發(fā)展過程中，不斷分化出結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的蛋白質(zhì)。因此，生物的變異不僅表現(xiàn)在生物的外部形態(tài)上，也必然要反映在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)上。,實(shí)例：細(xì)胞色素Ｃ,不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目,生物 與人不同的AA數(shù)目黑猩猩

11、 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、豬、羊、狗 11馬 12雞、火雞 13響尾蛇

12、 14海龜 15金槍魚 21角餃 23小蠅 25蛾 31小麥

13、 35粗早鏈孢霉 43酵母 44,,,第五節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì),一、蛋白質(zhì)分子的大小、形狀及分子量的測定二、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性三、蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)四、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)五、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 七、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì),一、蛋白質(zhì)分子大小、形狀及分子量測定,(一)

14、蛋白質(zhì)分子的大小分子量低于1萬 多肽 高于1萬 蛋白質(zhì),10000d=10kd,(二) 蛋白質(zhì)的分子形狀,根據(jù)擴(kuò)散系數(shù)、黏度或其他物理方法等可以推算出蛋白質(zhì)的不對(duì)稱常數(shù),,≈1 分子呈球形 >1 分子呈橢球形 >>1 分子呈纖維狀,蛋白質(zhì)是一類高分子化合物，其在溶液中的形狀可根據(jù)不對(duì)稱常數(shù)分為球形、橢圓形、纖維狀等。,(三) 蛋白質(zhì)分子量的測定,Western bl

15、ot,二、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性,變性,復(fù)性,變性 ：某些物理的和化學(xué)的因素使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，導(dǎo)致其生物活性的喪失和一些理化性質(zhì)的改變。,復(fù)性：蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性。,蛋白質(zhì)變性的學(xué)說最早由我國生化學(xué)家吳憲(1931)提出，他認(rèn)為天然蛋白質(zhì)分子受環(huán)境因素的影響，從有規(guī)則的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o規(guī)則的松散狀態(tài)

16、，即變性作用。,變性的本質(zhì) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的次級(jí)鍵受到破壞，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的改變或破壞，而不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變或肽鍵的斷裂。,變性的特征 (1)生物活性的喪失(2)某些理化性質(zhì)的改變 ： 溶解度；結(jié)晶能力；黏度；不對(duì)稱性；易水解,變性的因素和程度,物理因素：高溫、紫外線、X-射線、超聲波和劇烈振蕩等；化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、去污劑、重金屬(Hg2+、As+、Pb2+)、三氯醋酸

17、、濃乙醇等,如除去變性因素后，蛋白質(zhì)構(gòu)象可恢復(fù)者稱可逆變性；構(gòu)象不能恢復(fù)者稱不可逆變性。,變性的應(yīng)用,eg.酒精、紫外線消毒，高溫、高壓滅菌等是使細(xì)菌蛋白變性而失去活性； 中草藥有效成分的提取或其注射液的制備也常用變性的方法(加熱、濃乙醇等)除去雜蛋白； 在制備有生物活性的酶,蛋白質(zhì), 激素或其他生物制品(疫苗、抗毒素等)時(shí)，要求所需成分不變性，而不需要的雜蛋白應(yīng)使其變性或沉淀除去。此時(shí)，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)姆椒?/p>

18、，嚴(yán)格控制操作條件，盡量減少所需蛋白質(zhì)變性。有時(shí)還可加些保護(hù)劑、抑制劑等以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的抗變性能力,三、蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn),蛋白質(zhì)與氨基酸一樣在純水溶液和結(jié)晶狀態(tài)中都以兩性離子的形式存在，即同一分子中可帶有正負(fù)兩種電荷，羧基帶負(fù)電而氨基帶正電。,使蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零時(shí)溶液的pH，稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,四、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),,蛋白質(zhì)具有如布朗運(yùn)動(dòng)、光散射現(xiàn)象、不能透過半透膜以及具有吸附能力等膠體溶液的一般特征。,水化層

19、,蛋白質(zhì)水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體。蛋白質(zhì)形成親水膠體有兩個(gè)基本的穩(wěn)定因素：1、表面具有水化層 2、表面具有同性電荷 。,www.themegallery.com,Company Logo,蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用,透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液

20、中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒集聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（salting out）。 鹽溶: 加入少量中性鹽可增大蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象。,五、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng),1. 鹽析 (高濃度中性鹽，不變性) 2. 有機(jī)溶劑沉淀 3. 加熱變性沉淀 4. 重金屬鹽沉淀 5. 生物堿試劑沉淀 (或某些酸

21、類),沉淀= or ≠ 變性？,蛋白質(zhì)變性有時(shí)可表現(xiàn)為沉淀，亦可表現(xiàn)為溶解狀態(tài)；同樣，蛋白質(zhì)沉淀有時(shí)可以是變性，亦可以不是變性，這取決于沉淀的方法和條件以及是否對(duì)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象有無破壞而定。,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)是其氨基酸一些基團(tuán)以及肽鍵等與一定的試劑所產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)，并非是蛋白質(zhì)的特異反應(yīng)。,雙縮脲反應(yīng),雙縮脲反應(yīng) 蛋白質(zhì)在堿性溶液中可與Cu2+產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)。這是蛋白質(zhì)分子中肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多反應(yīng)顏色越深。,七

22、、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì),凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的抗體和(或)致敏淋巴細(xì)胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，統(tǒng)稱為抗原（antigen）。 抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合并具有免疫功能的免疫球蛋白，稱為抗體（antibody）。,近年來隨著對(duì)抗體理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及免疫化學(xué)的深入研究，將具有抗體活性以及化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱免疫球蛋白(immunoslobulin，Ig),抗原與抗體結(jié)合所引起反應(yīng)，稱

23、為免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)是人類對(duì)疾病具有抵抗力的重要標(biāo)志。,各抗原分子具有許多抗原決定簇。因此，由它免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的抗血清實(shí)際上是多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體(polyclonalantibodies)。用這種傳統(tǒng)的方法制備抗體，其效價(jià)不穩(wěn)定而產(chǎn)量有限，要想將這些不同抗體分離純化是極其困難的。,單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇、又是由單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體。它是結(jié)構(gòu)和特異性完全相

24、同的高純度抗體。,蛋白質(zhì)免疫性質(zhì)的應(yīng)用 疾病的預(yù)防、診斷和治療； 免疫分析：RIA 和EIA 分離純化：親和層析,第六節(jié) 蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理,蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)的純度鑒定和含量測定,蛋白質(zhì)的提取,材料的選擇——選擇合適的原材料組織細(xì)胞的粉碎——采用適當(dāng)方法將細(xì)胞破碎目的蛋白的提取——利用緩沖液將細(xì)胞內(nèi)的成分溶解出來,超聲破碎儀,手持勻漿機(jī),,細(xì)胞裂解液,www

25、.themegallery.com,Company Logo,蛋白質(zhì)的分離與純化,根據(jù)溶解度不同分離； 等電點(diǎn)沉淀；鹽析；低溫有機(jī)溶劑沉淀根據(jù)分子大小不同分離； 透析和超濾；分子排阻層析；密度梯度離心根據(jù)電離性質(zhì)不同分離； 電泳；離子交換層析根據(jù)配基特異性不同分離 親和層析,透析(dialysis)法是利用蛋白質(zhì)大分子對(duì)半透膜的不可透過性而與其他小分子物質(zhì)分開。此法簡便，常用于蛋白質(zhì)的脫鹽，但需時(shí)間較

26、長。,超濾法(ultrafiltration) 是利用超濾膜在一定的壓力或離心力的作用下，大分子物質(zhì)被截留而小分子物質(zhì)則濾過排出。 此法的優(yōu)點(diǎn)是可選擇性地分離所需分子量的蛋白質(zhì)、超濾過程無相態(tài)變化、條件溫和、蛋白質(zhì)不易變性，常用于蛋白質(zhì)溶液的濃縮、脫鹽、分級(jí)純化等。,凝膠過濾 ： 簡便而有效的生化分離方法之一。其原理是利用蛋白質(zhì)分子量的差異，通過具有分子篩性質(zhì)的凝膠而被分離。,分子排阻層析,離子交換層析,,,

27、利用蛋白質(zhì)是兩性化合物的特點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。,陰離子交換介質(zhì),上樣,淋洗,洗脫,在不溶性惰性載體上共價(jià)連接正電荷基團(tuán)，吸附和交換周圍環(huán)境中的陰離子(帶負(fù)電荷的蛋白)。,親和層析法 affinity chromatography,根據(jù)具有特異親和力的化合物之間能可逆結(jié)合與解離的性質(zhì)建立的層析方法，稱為親和層析。,,親和基團(tuán)配體,,,eg.抗原和抗體；protein A與 抗體；酶與底物/抑制劑,www.themegallery.

28、com,Company Logo,蛋白質(zhì)的純度鑒定和含量測定,純度鑒定方法 層析法(HPLC) 電泳法(PAGE & SDS-PAGE) 免疫化學(xué)法(RIA & EIA),www.themegallery.com,Company Logo,蛋白質(zhì)的含量測定,凱氏定氮法（Kjedahl法）福林-酚 試劑法 25~250ug/ml雙縮脲法