目標產(chǎn)品的蛋白質分析檢測

1、目標產(chǎn)品的蛋白質分析檢測技術與質量控制,曹純潔,2,主要內容,蛋白質含量和純度氨基酸的分析蛋白質的分子量測定蛋白質的等電點肽譜蛋白質突變點的分析蛋白質的二硫鍵的分析,3,一、蛋白質含量和純度,蛋白質濃度測定的方法：凱氏定氮法（繁瑣）、TCA比濁法、雙縮脲法（需樣品量大,不夠靈敏）、福林-酚法和紫外線法。已知摩爾消光系數(shù)時，可準確的計算出蛋白濃度：公式A=εCL。 L為內徑。C為摩爾濃度。摩爾消光系數(shù)（ ε ）的定義為：在

2、特定條件下，一定波長的光，光徑為1.00cm時，通過所含吸光物質的濃度為1.00 mol/L時的吸光度。 未知摩爾消光系數(shù)時，可測280nm和260nm光吸收值，用公式蛋白質濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 =1.45A280-0.74A260,4,考馬斯蘭G-250法：此試劑在酸性條件下與蛋白反應，當吸收峰由465nm轉移到595nm，靈

3、敏度高，測定蛋白的濃度范圍廣。遺傳工程產(chǎn)品蛋白質的純度要求：95%、99%、99.9%。常用鑒定蛋白純度的方法：聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-PAGE、毛細管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）、HPLC（包括凝膠過濾、各種反相HPLC、離子色譜、疏水色譜）,5,五種蛋白質測定方法比較,6,新的方法：如質譜法，僅pmol的樣品就能測定，同時能給出分子量。注意：只用一種鑒定蛋白純度的方法是不夠，往往幾種 （方法，機理）結合使用。,7,二、

4、氨基酸分析,檢測法的種類：氨基酸進行UV檢測只能利用羧基（-COOH）在200～210nm處的吸收。一部分具有苯環(huán)的氨基酸也可在250～280nm檢測，但是，一般對原物質（氨基酸）進行高靈敏度、良好選擇性的分析比較困難。 因此，很早以來就使用衍生法，利用許多氨基酸構造中存在的氨基（-NH2，-NHR），使用與該基團可進行選擇性反應的衍生試劑。檢測的儀器：HPLC或氨基酸分析儀,8,兩類方法：柱后反應法：將游離的氨基酸經(jīng)色譜柱分

5、離后，氨基酸再與顯色劑（茚三酮[吸光度檢測]、熒光胺、鄰苯二甲醛[熒光檢測]）作用，然后導入檢測器。優(yōu)點：反應可自動化，定量定性、重現(xiàn)性優(yōu)異。由于反應前試樣成分在柱中分離，“雜質”被去除，比較穩(wěn)定。,9,柱前衍生法： 將各種氨基酸和熒光試劑先作用生成衍生物，再分離，直接檢測衍生物的熒光。特點：反應系統(tǒng)小，試劑用量少?？墒褂酶邇r格的試劑，低背景，可提高靈敏度。即使檢測出未反應試劑，但經(jīng)柱分離，也不會影響檢測。,10

6、,氨基酸水解方法：通常是5.7mol/L HCl真空狀況下110℃水解24h，也有在150 ℃下快速水解4h。不同條件下，各種氨基酸的回收有所不同，且有的氨基酸會遭受破壞（如色氨酸）。保證氨基酸分析準確性的方法：過去用胰島素為標準樣品來判斷，近年來采用“測試肽法”，即將20種常見氨基酸人工合成一個20肽。然后水解，每種氨基酸殘基出現(xiàn)頻率是1，易于校正回收。,11,新的方法：毛細管電泳，僅需ng的量，分辨率和準確性均比SDS-

7、PAGE好。質譜，靈敏度和準確性都很好，精確度達0.01%。,12,13,三、蛋白質分子量的測定,早期方法：超離心、光散射法，需較高級儀器和較多的樣品，現(xiàn)很少使用。凝膠過濾法測蛋白質分子量。如Sephadex系列（G75、G100）等——HPLC凝膠過濾系統(tǒng)。測定是完整蛋白質分子量。實驗室常規(guī)方法：SDS-PAGE，用量約1ug，誤差為5-10%，但方便。測定蛋白質亞基的分子量。,14,毛細管等電聚焦電泳-電噴霧質譜技術（CIEF

8、-MS）：分辨率極高，能分辨的等電點差異小于0.04pH。一些標準樣品用此法分析可發(fā)現(xiàn)亞型（分子量完全一樣，等電點不同）的存在。如細胞色素C兩個亞型分別為9.60、9.55。一般的方法根本無法分辨。,15,四、蛋白質的等電點,等電聚焦法：可以測定蛋白質的等電點，同時可鑒定蛋白的純度。毛細管等電聚焦法：能測定偏堿性的蛋白質的等電點，如天花粉蛋白的等電點測定。,16,五、肽譜,肽譜技術：是指蛋白質被酶解或化學降解后肽段的分離分析或制備

9、。1、裂解方法：用酶或化學法裂解蛋白質成肽段。 酶解：胰蛋白酶（切堿性氨基酸如Arg,lys的C端）Lys-C內肽酶只作用于Lys-X鍵；梭菌蛋白酶只作用于Arg-X鍵。V8蛋白質只專一作用于負電性氨基的C端（Glu,Asp）；在pH=4條件下，V8只作用于Glu-X鍵。,17,化學裂解：最常用的是溴化氰，作用于Met C端和其次一個AA的肽鍵。如γ-干擾素有4個Met，可被裂解成5肽段。BNPS-3甲基吲哚、N-氯代琥

10、珀酰亞胺作用于Trp-X鍵上；2-硝基-5硫氰基苯甲酸作用在X-Cys鍵上；羥胺作用在Asn-Gly鍵上。,18,,2、肽譜分析肽譜分析一般用HPLC和CE來進行：HPLC主要是用RP-HPLC根據(jù)肽的長短和疏水性來分離。當肽親水性強，用HPLC不能帶留在柱內，達不到分辨效果；或當肽疏水性很強，粘在柱上洗不下來時，可用CE來進行。SDS-PAGE：當裂解成的肽段較大時，可進行。當對于小分子肽時，往往無法分辨。質譜分析蛋白

11、質的酶解產(chǎn)物，多肽出現(xiàn)先后按分子量大小排列。,19,六、蛋白質突變點的分析,例子：人白細胞介素-2的突變點分析。133AA，第125是一游離Cys，第58位和第105位半胱氨酸形成二硫鍵（活性必需）。鑒定IL-2的蛋白質工程(Cys-Ser/Ala)突變點：用TPCK-胰蛋白酶水解后，進行RP-HPLC分離分析。天然IL-2和新型IL-2的酶解圖譜比較尋找有差別的肽進行順序分析；熒光標記Cys殘基，比較標記前后新型IL-2酶解圖譜

12、的差別，從而鑒別出點突變的肽；同位素標記法；利用IL-2只有一個色氨基酸，280nm主要是色AA吸收其次是酪AA和苯丙氨酸，酶解后分別用214nm和280nm檢測，可找到含色AA的肽段——用CE確定為均一——AA序列分析——證實新型IL-2的Ser（125）取代了Cys。,20,酶解后，用液質分析，尋找與理論值分子量不一致的肽段。,21,新的方法：CE-MS聯(lián)機來檢測IL-2突變點，更快速和準確。,22,七、蛋白質的二硫鍵分析,二硫

13、鍵的錯配，生物活性只有原來的1/400。分析方法：IL-2（3個Cys）：用同位素標記，pH=8.5用3H-碘代乙酸處理IL-2，只有游離的巰基才與其作用，然后還原，再用14C-碘代乙酸烷化。故如3H-標記僅在肽11上，14C-的放射性全在肽12和肽14上，則和天然結構是一致的。SOD（3個Cys）:可用同樣的方法。直接分析二硫鍵的異構物。IL-2在堿性條件下形成二硫異構體（58與125位或105與125形成二硫鍵），反相色譜中