第五章細胞因子-醫(yī)學全在線-國家醫(yī)學考試網國家醫(yī)學教育

1、第二十五章      免 疫 學 診 斷,教 學 要 求:1 掌握凝集反應、沉淀反應的定義及其基本類型。2 掌握間接免疫熒光法和ELISA的雙抗夾心法及間接法的基本操作步驟。3 熟悉檢測體液免疫和細胞免疫的常用試驗方法。4 了解免疫學檢測方法的應用。,第二十四章      免疫學診斷,免疫學診斷即用免

2、疫學方法確定疾病相關因子、監(jiān)測疾病過程、判斷療效及預后，涉及對疾病相關因子的診斷和輔助診斷，以及檢測機體免疫功能狀態(tài)。 第一節(jié) 抗原或抗體的檢測 抗原抗體反應原理：抗原的抗原決定基與抗體的結合部位之間的結構應具有互補性，二者相互結合后，在適宜條件下，可出現可見反應。,免疫學診斷,一、抗原抗體反應的特點（一）抗原抗體反應的特異性

3、 指一種抗原只能與由它刺激所產生的抗體結合的專一性。它是免疫學診斷的重要基礎。 1 親和力(affinity)：抗體分子上一個抗原結合部位與相應的抗原決定基之間的結合強度。 2 親合力(avidity):一個抗體分子與整個抗原之間的結合強度。 3 抗血清： 4 一抗： 5 二抗：,免疫學診斷,（二）抗原抗體反應的可見性： 抗原、抗體比例適合時，在適

4、宜的鹽濃度下可形成肉眼可見的反應物（凝集物或沉淀物）。（三）抗原抗體反應的可逆性： 抗原抗體之間的結合主要是分子表面的非共價鍵結合，穩(wěn)定，但在適當條件（如低pH、高濃度鹽、凍融等）下可解離開，各自的生物學特性不發(fā)生改變。根據此特點，可利用親合層析法純化抗原或抗體。,,（五）影響抗原抗體反應的因素：P379 1 溫度：適當的溫度可增加抗原與抗體分子碰撞的機會， 加快二者結合速度。不宜過高過低。2 電解

5、質：可使IC復合物失去電荷而凝聚，出現可見反應。常用生理鹽水稀釋抗原或抗體。,免疫學診斷,3 酸堿度：最適pH6～8，否則可出現假陰或假陽性結果 4 抗原和抗體性質：抗體的特異性和親和力是關鍵，初次應答抗體親和力低，單克隆抗體親和力低；抗原理化性質、抗原表位多寡等。,二 抗原或抗體的檢測方法,根據抗原的性質、出現結果的現象、參與反應的成分不同，可將抗原抗體反應分為下列幾類： （一）凝集反應（agglutination)

6、 P381 細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后，在適宜電解質下形成肉眼可見凝集物的反應。,,1. 直接凝集：玻片和試管凝集2 間接凝集： 正相間接凝集和反向間接凝集。 補充介紹：3. 協(xié)同凝集：以SPA為載體的反向間接凝集。在微生物檢測中常用。4. 間接凝集抑制試驗：,,,抗原或抗體的檢測方法,（二）沉淀反應（precipitation)： p380

7、 血清蛋白質、細菌裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后，在有電解質存在時，出現肉眼可見的沉淀物的反應。 1 單向免疫擴散 (single immunodiffusion)（1）特點：定性定量試驗（2）用途：可用于測定血清IgG,IgM,IgA和C3等的含量（3）原理：沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關。（4）操作：鋪板 打孔 加樣

8、 放濕盒 看結果。,,,,,,,,,,,,,,,2 雙向免疫擴散(double immunodiffusion)（1）特點：定性半定量（2）用途：用于抗原或抗體的定性檢測、組成和多抗原相 關性分析。（3）操作：鋪板 打孔 加樣 放濕盒 看結果 。,,,,,,3 對流免疫電泳試驗 （補充介紹） 其實質是將

9、雙擴與電泳相結合。（1）特點：定性試驗（2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性檢測。（3）操作：鋪板 打孔 加樣 電泳 看結果 。,,,,,,,,4 免疫電泳 （immunoelectrophoresis) 也是將電泳技術與雙向免疫擴散結合的一種技術，先電泳后雙向免疫擴散（見圖） 。,,5 免疫比濁 （immunoephel

10、ometry） 在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經一定時間形成IC，液體渾濁，用濁度計測反應體系的濁度，據標準曲線推算樣品中抗原含量。,,（四）免疫標記技術 P381 用熒光素、酶、放射性核素等標記抗原或抗體后進行抗原抗體反應。提高檢測靈敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫熒光標記技術,1 免疫熒光法 可對標本中的抗原進行鑒定和定位。常用的

11、熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE），前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。 用途：可用于檢查細菌、病毒、螺旋體等的抗原或抗體，幫助診斷傳染病；也可用于鑒定免疫細胞的CD分子，檢測AID的抗核抗體等。,,（1）直接法：缺點是每檢查一種抗原必須制備相應的熒光抗體。（2）間接法：敏感性比直接法高，制備一種熒光二抗可用于多種抗原的檢查，但非特異性增多。,,,,,,2. 酶免疫測定： 是將

12、抗原抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合。敏感度可達1ug/L,甚至1ng/L。常用的標記物有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）等。 常用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）測定可溶性抗原或抗體，用酶免疫組化法測定,免疫酶標記技術,組織中或細胞表面的抗原。（1）ELISA: ① 雙抗體夾心法：用于檢測可溶性的特異性抗原。

13、 操作基本步驟：用已知抗體包板 洗滌 封板 洗滌 加入待檢標本 洗滌 加酶標抗體 洗滌 加底物顯色 結果觀察。,,,,,,,,,,免疫酶標記技術,②間接法：檢測特異性抗體。非特異性增加。 基本步驟：用已知抗原包板 加入待檢標本

14、 加酶標二抗 加底物顯色 觀察結果。,,,,,,,免疫標記技術,（2）酶免疫組化法： 將酶標抗體與組織或細胞表面的抗原反應后，結合形態(tài)學檢查，對抗原進行定性、定量、定位檢測。 3 放射免疫測定法： 用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學檢測，敏感度可達pg水平。常用于檢測微量物質，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、嗎啡、地高辛藥物和

15、IgE等。,,4 免疫印跡法：P383 又稱Western-blotting，用于蛋白質檢測。是將凝膠電泳與固相免疫結合，把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體后，再用酶免疫、放射免疫等技術測定。?？蓹z測多種病毒的抗原或抗體。,第二節(jié) 淋巴細胞的測定,淋巴細胞是機體內主要的免疫細胞，檢測其數量和功能是了解機體免疫狀態(tài)的重要手段。 一 淋巴細胞的分離 常用fico

16、ll（淋巴細胞分離液）密度梯度離心除去紅細胞、粒細胞而獲得外周血單個核細胞（PBMC），再經吸附除去單核細胞而得到淋巴細胞。若要分離T細胞，可用尼龍毛柱、抗CD3單抗、E花結試驗等分離。,,,二、淋巴細胞的鑒定 P386 根據淋巴細胞的某些標志，采用免疫熒光法、磁珠分離法、流式細胞術等方法可確定細胞的不同類型和比例。（一）T細胞功能測定 1. T細胞增殖試驗

17、 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）等絲裂原及抗CD3單抗等能非特異性激活培養(yǎng)的T細胞，使其轉化成淋巴母細胞的試驗。,淋巴細胞功能測定,在該增殖過程中，細胞DNA、RNA、蛋白質的合成增加，細胞形態(tài)改變。也可檢測特異性抗原致敏的T細胞。 （1）氚標記的胸腺嘧啶核苷摻入法：該法靈敏、可靠，應用廣泛，但需特殊儀器（液體閃爍儀），易有放射性污染。 （2）MTT法：該法操作簡單，無放射性污染，但敏感性相對較差。,淋巴

18、細胞功能測定,2 細胞毒試驗： Tc、NK細胞對靶細胞有直接殺傷作用，可根據待檢效應細胞的性質，選用相應的靶細胞。 （1）51Cr釋放法：用51Cr標記靶細胞，γ記數儀測定釋放的51C活性。 （2）MTT法：其原理與增殖試驗相同，但甲 生成量與靶細胞溶解破壞水平呈負相關。,,3 細胞因子檢測： CK的檢測有助于了解其在免疫調節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細胞，監(jiān)測某些

19、疾病狀態(tài)的細胞免疫功能。常用的檢測方法有以下三種：（1）ELISA法：（2）生物活性測定法：（3）聚合酶鏈反應（PCR）：,淋巴細胞功能測定,4 皮膚實驗 正常機體對某種抗原產生細胞免疫后，用相同抗原做皮膚試驗時出現以局部紅腫為特征的DTH。細胞免疫正常時出現陽性反應，細胞免疫低下則呈陰性反應。 該方法簡便，可幫助診斷某些病原微生物感染（如結核桿菌、麻風桿菌等）及免疫缺陷病等