蛋白質(zhì)類藥物分析

1、第九章 蛋白質(zhì)和多肽類藥物的分析,第一節(jié) 概述,一、蛋白質(zhì)和多肽重要理化性質(zhì)二、蛋白質(zhì)和多肽類藥物質(zhì)量控制標(biāo)準三、蛋白質(zhì)和多肽類藥物的活性及測定方法,一、主要理化性質(zhì),高分子特性：是其膠體性、變性和免疫學(xué)特性基礎(chǔ)兩性解離與等電點：影響多肽、蛋白質(zhì)分離、純化和分析顏色反應(yīng)：茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、酚試劑反應(yīng)紫外吸收：280nm處最大吸收，可定量蛋白質(zhì)和多肽,（一）高分子特性,是其膠體性、變性和免疫學(xué)特性的基礎(chǔ),1、膠體性質(zhì),可溶

2、性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體（Φ1-100nm）。,疏水色譜,2、變性與復(fù)性,蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)是其理化特性及生物學(xué)功能基礎(chǔ)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受某些理化因素影響，其分子內(nèi)原有高級構(gòu)象發(fā)生變化，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和生物學(xué)功能改變或喪失，但一級結(jié)構(gòu)未變，即變性作用(denaturation) 表征：生物活性喪失；物理

3、（溶解度、粘度、擴散系數(shù)、光譜特性）和化學(xué)（化學(xué)反應(yīng)，被酶解性）改變.,生物活性,3、凝集（Aggregation）,（二）兩性解離與等電點,影響多肽、蛋白質(zhì)分離、純化和分析,（三）顏色反應(yīng),可用于蛋白質(zhì)定量與定性分析 1）茚三酮反應(yīng) 2）雙縮脲反應(yīng) 3）酚試劑反應(yīng),雙縮脲反應(yīng),紅紫色絡(luò)合物,,(堿性溶液),Cu2+,（四）紫外吸收,,蛋白質(zhì)和多肽組成中常含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在

4、遠紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰,二、蛋白質(zhì)和多肽類藥物質(zhì)量標(biāo)準,（一）原液質(zhì)量標(biāo)準（二）成品質(zhì)量標(biāo)準,（一）原液質(zhì)量標(biāo)準,生物學(xué)活性、比活性（見藥典附錄ⅩC）蛋白質(zhì)含量（見Chp附錄ⅥD）純度：≥95%，非還原SDS-PAGE（見Chp附錄ⅣC）、HPLC法（見Chp附錄ⅢB）分子量：還原型SDS-PAGE法（見Chp附錄ⅣC）、質(zhì)譜法外源性DNA殘留量：≤10ng/劑量（見Chp附錄

5、ⅨB）,宿主蛋白殘留量：≤0.1%，0.05%（見Chp附錄ⅨC）殘余抗生素：不得檢出（見Chp附錄ⅨA）細菌內(nèi)毒素：≤10EU劑量（見Chp附錄ⅫE凝膠限量試驗）結(jié)構(gòu)確證：等電點（見Chp附錄ⅣD）、紫外吸收光譜掃描（見Chp附錄ⅡA）、N末端15個氨基酸順序、肽圖（見Chp附錄ⅧE）、氨基酸組成,（二）成品質(zhì)量標(biāo)準,鑒別試驗：免疫印跡或斑點法，陽性物理檢查：外觀、可見異物、裝量化學(xué)檢查：水分、pH值生物學(xué)活性：標(biāo)示值的%

6、范圍無菌檢查：不得檢出內(nèi)毒素檢查：≤10EU劑量異常毒性檢查：符合規(guī)定,三、蛋白質(zhì)和多肽類藥物活性及測定方法,（一）生物學(xué)活性及比活性測定（二）生物學(xué)活性測定方法分類（三）生物學(xué)活性測定方法選擇（四）生物學(xué)活性測定（五）蛋白質(zhì)藥物的比活性,（一）生物學(xué)活性及比活性測定,檢測意義獲取準確的效價信息，保證產(chǎn)品有效效價：有效性指標(biāo)，反映藥品效力生物學(xué)活性才能真實反映生物技術(shù)藥效價原因：生物制品分子大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不穩(wěn)定，使

7、得重量與效價不一致生物制品技術(shù)藥:單位（U、AU、IU）,（二）生物學(xué)活性測定方法分類,1、動物基礎(chǔ)的活性測定 1）離體動物器官法：腦利鈉肽的兔主動脈 2）體內(nèi)測定法：EPO的小鼠網(wǎng)織紅細胞2、細胞基礎(chǔ)的活性測定 1）促細胞生長法：大多數(shù)細胞因子類 2）抑制細胞生長法：細胞毒素、血管抑制劑 3）間接保護細胞法：IFN保護WISH3、酶學(xué)基礎(chǔ)的活性測定：重組酶類4、受體-配體、抗原

8、-抗體結(jié)合基礎(chǔ)的活性測定：抗原決定簇與活性中心常不一致,（三）生物學(xué)活性測定方法選擇,1、細胞培養(yǎng)法＞離體器官法＞體內(nèi)法2、細胞染色標(biāo)記方法：MTT＞3H-Thymidine＞流式細胞儀（測細胞周期）3、定量法＞半定量法＞定性法4、生物學(xué)活性不一定與臨床藥效類型一致工藝穩(wěn)定、測生物活性特別復(fù)雜時，可替代。如rh-GH用HPLC,（四）生物學(xué)活性測定（Chp附錄ⅩC）,樣品：原液、成品標(biāo)準：不同生物活性測定方法的規(guī)定標(biāo)準

9、 測定方法 規(guī)定標(biāo)準 動物基礎(chǔ)的活性測定 70%~130%標(biāo)示量 細胞基礎(chǔ)的活性測定 80%~120%標(biāo)示量 酶學(xué)基礎(chǔ)的活性測定 85%~115%標(biāo)示量 結(jié)合反應(yīng)的活性測定 85%~115%標(biāo)示量,（五）蛋白質(zhì)藥物的比活性,樣品：原液定義與計算：比活性：單位重量蛋白的活性單位（IU/mg）意義：真實反映有活性的

10、蛋白質(zhì)所占的比例，廠家間、表達系統(tǒng)間、批間比較便于配制成品,第二節(jié) 蛋白質(zhì)和多肽類藥物分析,一、鑒別二、結(jié)構(gòu)確證三、檢查四、含量測定五、殘余雜質(zhì)檢測六、安全性及其他檢查,一、鑒別,鑒別藥物的真?zhèn)危ㄒ唬┗瘜W(xué)鑒別：雙縮脲反應(yīng)（是否蛋白質(zhì)/多肽類）,（二）紫外吸收光譜掃描（Chp附錄ⅡA）,樣品：原液方法：紫外掃描標(biāo)準：最大吸收波長與特征波長一致、批與批間一致一級結(jié)構(gòu)不含芳香族氨基酸重組藥物，在280nm附近沒有最大吸收峰

11、，可不做紫外吸收光譜測定,重組腦利鈉肽(rhBNP),（三）免疫印跡,方法：通常用免疫印跡（immunoblotting）和斑點免疫（Dot Immunobinding）進行鑒定，特別當(dāng)電泳出現(xiàn)兩條或兩條以上區(qū)帶時則應(yīng)該用免疫印跡進行鑒定標(biāo)準：陽性,（四）HPLC法,根據(jù)待測樣品（T）與標(biāo)準品（S）/對照品方法的保留時間（t0）的一致性進行定性分析當(dāng)T的t0與S完全相同，則能判定T可能與S為同一物質(zhì)；特別是如果色譜條件改變，T的t0

12、與S的t0仍能一致，則基本判定是同一物質(zhì),二、結(jié)構(gòu)確證,等電點（PI）測定紫外光譜掃描末端氨基酸序列測定肽圖分析氨基酸組成分析,（一）等電點測定（Chp附錄ⅣD）,不同蛋白質(zhì)或多肽具有不同等電點，可以表征藥物純度等電點測定是控制重組產(chǎn)品生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的重要指標(biāo)：均一的重組蛋白質(zhì)只有一個等電點，有時因加工修飾等影響可出現(xiàn)多個等電點，但應(yīng)有一定的范圍,方法： 1）等電聚焦電泳法（IEF）： 2）毛細管電泳法

13、（CE）：該法用紫外檢測，適用于某些不易染色的Pr/多肽，如EGF、hCGRP等制品的測定標(biāo)準:標(biāo)準：有明顯主帶、理論值±0.5pH范圍、批與批間一致,（二）末端序列分析（Chp附錄ⅧE）,作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒別指標(biāo)，一般要求： 1、N末端：15個殘基（Edman化學(xué)降解法、Pr全自動測序儀） 2、C末端：1-3個殘基（羧肽酶降解法、RP-HPLC），但在我國現(xiàn)有法規(guī)中C端不一定要測定封閉N-末

14、端測定（N-末端乙?；?、焦谷式N-末端）標(biāo)準：與理論值一致、批與批間一致,de novo Protein Sequencing,1、N-端測序,方法：Edman化學(xué)降解法-異硫氰酸苯酯（PITC)法樣品處理： 1）純度鑒定：≥97% 2）脫鹽 3）巰基保護：碘代乙酰胺 4）去除N-端封閉的基團：酸水解、酶處理,2、C-末端測序,方法：羧肽酶法 羧肽酶是一種肽鏈外切酶，能從多肽鏈的C端逐個

15、水解氨基酸。根據(jù)不同反應(yīng)時間測出酶水解所釋放氨基酸種類和數(shù)量，從而知道Pr的C末端殘基順序由于羧肽酶對不同的C末端氨基酸作用的速度不同，且反應(yīng)是連續(xù)的，不能停在某一步上，給正確判斷氨基酸順序造成了一定困難,4種常用羧肽酶,19種標(biāo)準氨基酸色譜圖,N-端序列分析，二硫鍵定位分析，檢查位點修飾情況（如糖基化或磷酸化）,（三）肽圖分析（Chp附錄ⅧE）,概念：根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的氨基酸排列順序，使用各種定位裂解方法將蛋白質(zhì)、多肽裂解成大小固定

16、的多個小分子肽鏈，通過分離并檢測，形成可供鑒別的特征性指紋圖譜意義:一級結(jié)構(gòu)，工藝穩(wěn)定性方法：溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE /CE/質(zhì)譜法標(biāo)準：有特征性圖譜/批與批間一致,化學(xué)裂解法：非特異性降解，裂解位點少蛋白酶裂解法：特異性降解，裂解位點較多特殊處理: 二硫鍵、空間構(gòu)象較復(fù)雜特殊產(chǎn)品,肽圖裂解方法,肽圖分析方法,RP-HPLCCEHPLC-MSSDS-PAGE,Tryptic peptide ma

17、pping of recombinant human erythropoietin in phosphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary electrophoresis. The upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells

18、) but subsequently treated with N-glycanase,Comparability Analysis by Peptide Mapping LC-MS/MS for a biosimilar mAb to its original mAb identified an amino acid mutation and several PTMs (oxidation and deamidation), show

19、n by the red arrows, as compared to the biosimilar mAb.,Sequence coverage and Peptide-mass fingerprinting of CRM197 digested with acid hydrolysis and LysCby, respectively.,利妥昔單抗肽圖分析,Tryptic peptide map analysis of stabi

20、lity monoclonal antibodies by hydrophobic interaction chromatography. Selected region of tryptic peptide maps of a stability sample held at 40°C for 0 weeks (black), 12 weeks (blue), or 24 weeks (red).,HPLC pattern

21、of S. aureus fingerprint of human(a) and bovine (b) insulin,（四）氨基酸組成分析,結(jié)構(gòu)分析的輔助手段，質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。對水解后產(chǎn)生的氨基酸種類定量測定，獲得各種氨基酸摩爾比，對蛋白質(zhì)/多肽進行鑒別在試生產(chǎn)的頭三批或工藝改變時應(yīng)當(dāng)測定方法：HCl/NaOH水解（僅用于Trp測定）+氨基酸自動分析儀標(biāo)準：與理論值一致，批與批間一致,3個步驟，即：,氨基酸組成分析步驟,R

22、epresentative chromatograms for hydrolysate amino acids and free amino acids,1、蛋白質(zhì)及肽水解方法,雖然多肽的氨基酸組成分析已向更靈敏、更精確、更快速以及自動化方向發(fā)展和改進，但還沒有一種單獨適用于所有殘基的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出現(xiàn)，很多因素如溫度、時間、水解試劑、添加劑、水解方法等對水解的完全程度均有影響,（1）酸性水解,HCl是最通用的水解

23、劑（6mol/L HCl、真空、110℃，20～24h）優(yōu)點：氨基酸不消旋缺點：Trp被完全破壞；Ser、Met有部分被破壞，損失分別為10%和5%；Thr部分被水解液中痕量雜質(zhì)所破壞；Cys水解后會轉(zhuǎn)換成Cys-Cys，Asn和Gln被水解成Asp 和 Glu,（2）堿性水解,水解劑NaOH和KOH（5mol/L NaOH，充氮氣，110℃，22h）優(yōu)點：HCl水解的互補法，限于測定Trp的含量缺點：多數(shù)氨基酸或遭到破壞，或外

24、消旋化,（3）酶水解,用一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對化學(xué)水解敏感的氨基酸如Asn和Gln的測定優(yōu)點：水解過程中氨基酸不發(fā)生消旋化，氨基酸不被破壞缺點：反應(yīng)需時長，水解不完全。另外，因為酶白質(zhì)可能干擾樣品的測定,2、特殊氨基酸的保護,不同水解條件下，各種氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半胱氨酸可能遭水解破壞，導(dǎo)致無法正確測定其含量。因此水解過程中，需要考慮對特殊氨基酸的保護,（1）Trp的保護,酸水解液中加入巰基乙酸

25、和β-巰基乙醇，可使Trp的回收可達80％；3mol/L疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸對色氨酸進行保護利用蛋白酶作為水解劑，對Asn和Gln及Trp均無破壞作用用氫氧化鈉和氫氧化鋇代替酸水解，可保護Trp不被破壞,（2）Cys的保護,柱前衍生化： 色譜柱：RP HPLC 衍生化方法：異硫氰酸苯酯（PITC）法、鄰苯二醛（OPA）法、9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法、6-

26、氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）法柱后衍生化： 色譜柱:陽離子交換色譜柱 衍生化方法：茚三酮反應(yīng),3、氨基酸的衍生化,（1）PITC柱前衍生分析法,原理：氨基酸與PITC反應(yīng)，生成有紫外響應(yīng)的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經(jīng)RP HPLC分離后用紫外檢測，其吸光值與氨基酸濃度成正比線性濃度范圍：0.025~1.25µmol/ml,（2）AQC柱

27、前衍生分析法,原理：氨基酸與AQC反應(yīng)，生成有紫外與熒光響應(yīng)的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經(jīng)RP HPLC分離后用紫外或熒光檢測，其吸光值與氨基酸濃度成正比線性濃度范圍：2.5~200nmol/ml,（3）OPA和FMOC柱前衍生法,原理：在巰基試劑存在下，首先與OPA反應(yīng)，生成OPA-氨基酸；然后加入FMOC繼續(xù)反應(yīng)，生成FMOC-氨基酸，經(jīng)RT HPLC分離后用紫外或熒光檢測，其吸光值與氨基酸濃度成正比線性

28、濃度范圍：0.025~2.5µmol/ml,The figure shows typical traces for a mixture of standard amino acids (left) and a peptide hydrolysate (right), so that it is possible to identify which amino acids are present in the peptide.,

29、（4）DNFB柱前衍生分析法,原理：氨基酸與DNFB反應(yīng)，生成有紫外響應(yīng)的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經(jīng)RT HPLC分離后采用紫外檢測，在一定的范圍內(nèi)其吸光值與氨基酸濃度成正比線性響應(yīng)范圍：30~140 pmol,（5）茚三酮柱后衍生分析法,原理：氨基酸經(jīng)陽離子交換色譜柱分離后，與茚三酮反應(yīng)，除Pro和Hpro產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它氨基酸都產(chǎn)生藍紫色物質(zhì)，分別在440nm和570nm下檢測上述反應(yīng)產(chǎn)物，其吸光值與氨

30、基酸濃度成正比線性響應(yīng)范圍：20~500 pmol,（五）相對分子質(zhì)量測定,1、還原型SDS-PAGE法（Chp附錄ⅣC）適用范圍：Mr為15～200kD標(biāo)準：理論值±10％范圍，批與批間一致,2、質(zhì)譜法特點：具有準確、快速，重復(fù)性好，測定范圍廣等特點適用范圍：Mr＜10kD的Pr和多肽,Multiply charged ion peaks of myoglobin analyzed by ESI-ion trap

31、mass spectrometer,（六）二級結(jié)構(gòu)測定,通常采用圓二色光譜(CD）測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。,mdeg,Wavelength (nm),200,220,The far-UV CD spectra were obtained before and after 276 nm light continuous exc. (0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2.5 h, 3.5 h, and 7 h) of ins

32、ulin in solution. There is a progressive loss of ellipticity signal with 276 nm exc. time at 195, 209 and 222 nm.,Circular dichroism spectrometry in the ultraviolet wavelength region (UV-CD) of MBP-cytochrome b fusion pr

33、otein in different detergent solutions.,（七）二硫鍵定位,Theoretical S. aureus protease fragmentation of human insulin (●，residues of glutamine),二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)。對二硫鍵的分析雖然在常檢定項目中沒有規(guī)定，但在質(zhì)量研究中應(yīng)盡可能分析清楚有些產(chǎn)品二硫鍵較多，用現(xiàn)有的技術(shù)完全分析清楚很困難，

34、可以結(jié)合其他項目的檢測，如比活性等進行有效的質(zhì)量控制,方法：碘代乙酰胺保護游離巰基，胃蛋白酶水解樣品（切點多，酸性環(huán)境下防止二硫鍵交換），將所得肽段用對角線電泳分離,對角線電泳,蛋白質(zhì)寡糖可以上調(diào)、下調(diào)或抑制糖蛋白的生物活性，影響蛋白質(zhì)代謝命運、穩(wěn)定性或溶解性通過基因工程方法將一種糖蛋白在不同細胞中表達，可以導(dǎo)致生產(chǎn)不同類型的糖蛋白；即使在相同的細胞類型中，也可能會出現(xiàn)糖形成時由于一些寡糖的精細結(jié)構(gòu)不同和普通寡糖產(chǎn)生的相對頻率不同而產(chǎn)

35、生截然不同的糖蛋白,（八）糖基化分析,糖基化分析內(nèi)容： 糖基化位點、分子量、糖組成、連接方式分析方法： 酶解、質(zhì)譜、LC/MS、GC/MS,CE analysis of IgG glycans. Lower trace: High resolution analysis of APTS derivatized IgG glycans, Upper trace: CE separation of AP

36、TS derivatized maltooligosaccharide ladder,Tryptic peptide mapping of recombinant human erythropoietin in phosphate buffer, pH 2.5, with 100 mM heptanesulfonic acid by capillary electrophoresis. The maps from two differe

37、nt expression systems are shown, the upper without glycosylation (E. coli), the lower with (Chinese Hamster Ovary cells) but subsequently treated with N-glycanase.,三、檢查,檢查內(nèi)容：純度；相關(guān)雜質(zhì)（產(chǎn)品相關(guān)、工藝過程相關(guān)）（一）多肽類藥物（二）蛋白質(zhì)類藥物,（一）多肽類

38、藥物,氨基酸比值：通過氨基酸分析法測定其各種氨基酸比值有關(guān)物質(zhì)：合成過程中產(chǎn)生的肽類雜質(zhì)、降解雜質(zhì)、聚合物和光學(xué)雜質(zhì)，采用梯度洗脫RP HPLC或毛細管電泳法醋酸：多肽類藥物多為其醋酸鹽，采用RP HPLC,（二）蛋白質(zhì)類藥物,有關(guān)物質(zhì)：相關(guān)Pr雜質(zhì)，采用梯度洗脫RP HPLC高分子蛋白質(zhì)：高分子聚合物，采用分子排阻色譜法生物活性：生物檢定,1、純度檢查,樣品：原液方法：必須采用兩種方法測定（非還原SDS-PAGE和HPLC）

39、標(biāo)準：純度均達到95%或98%以上,（1）非還原SDS-PAGE法（Chp附錄ⅣC）,SDS-PAGE：據(jù)分子大小分離樣品處理：樣品不加β-ME或DTT（二硫鍵未打開，反映單體、二聚體和多聚體情況）染色方法與上樣量：銀染，5μg（檢測限為1-10 ng）；考馬斯亮藍R-250，10μg（檢測限為0.1μg）定量方法：凝膠掃描，以峰面積按歸一化法計算標(biāo)準：無明顯雜帶，純度≥95%或98%執(zhí)行《中國藥典》三部的生物制品應(yīng)采用銀

40、染A 法,膠濃度對電泳結(jié)果的影響,上樣量對電泳結(jié)果的影響,染色方法對電泳結(jié)果的影響,蛋白質(zhì)制劑在保存期間易形成聚合體，并隨蛋白質(zhì)濃度和保存溫度的升高而增加，這些作用直接影響此類制品的安全性和有效性多聚體形成有很多原因：氧化、疏水、濃度和pH直接關(guān)系,（2）HPLC法（Chp附錄ⅢB）,保證T中所有組份均出峰的情況下，用T峰面積/峰高除以所有峰面積/峰高總和即目標(biāo)Pr純度應(yīng)根據(jù)不同的純化工藝選擇不同方法，一般盡量采用與SDS- PAG

41、E法原理不同的反相柱或其他離子交換柱進行分析，而不主張用分子篩分析在質(zhì)量標(biāo)準中要說明采用的是什么性質(zhì)的分析柱，如有些產(chǎn)品不適合用反相柱，要說明原因,分析柱：反相柱、離子柱、分子篩（應(yīng)盡量采用反相柱或離子柱，應(yīng)注明采用分析柱的性質(zhì)）上樣量：5μg標(biāo)準：出峰時間正確，純度≥95%或98%,The analysis of MAb shows that resolution of monomer and aggregate peaks

42、is higher on the SuperSW column, as is the detection sensitivity,A minor impurity or fragment detected in HSA by UHPLC with a 300mm size-exclusion column and UV + UT-rEX RI. The different UV:RI ratio of the fragment rela

43、tive to the monomer and dimer indicate a different primary composition,TSKgel SuperSW mAb HTP showed superior resolution of mAb dimer and monomer even at high flow rates with low pressure,如何認識蛋白質(zhì)類藥物純度檢測？,從蛋白質(zhì)制劑中檢測出少量污染蛋

44、白質(zhì)很困難：①污染蛋白質(zhì)的量可能低于很多測定方法檢測下限；②制劑中往往含有大量輔料當(dāng)用一種方法測定蛋白質(zhì)純度時，可能有兩種或更多的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相似行為，只用一種方法作為純度試驗標(biāo)準很不可靠,建立多種分析方法，須從等電點、相對分子質(zhì)量、疏水性等不同角度來證明蛋白質(zhì)樣品的均一性純度結(jié)論取決于所用方法類型和分辨力，低分辨率方法檢測合格的樣品改用高分辨力方法時可能證明不純沒有一個真正檢驗純度的方法，只有檢測樣品不純或非均一的方法,四、含量

45、測定（Chp附錄ⅥD）,目的主要用于原液比活性計算和成品規(guī)格的控制采用Folin-酚試劑法(Lowry法)、染色法(Bradford法)、雙縮脲法、紫外吸收法和HPLC法等方法，其中Lowry法和Bradford法是在質(zhì)量檢定中經(jīng)常使用的方法,1、Folin-酚試劑法(Lowry法),原理：在堿性溶液中蛋白質(zhì)肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，該藍色化合物在650nm處的吸光度與蛋白

46、質(zhì)含量成正比用于微量蛋白質(zhì)的含量測定，靈敏范圍：5～100μg/ml,優(yōu)點：方法簡便，靈敏度較高；所用儀器簡單，不同T間的變異少，需時約40min，優(yōu)先采用缺點：Folin 試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此蛋白質(zhì)中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用；不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同,2、Bradford法,原理：考馬斯亮藍G-250（CBB G-250，λmax=488nm）與蛋白質(zhì)結(jié)合

47、后形成藍色化合物，在595nm處有最大吸收峰，且藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。國外已將重組制品將Bradford法作為樣品含量常規(guī)檢定方法靈敏范圍：25～200μg/ml；0.1ml的最小體積可測得的最低蛋白質(zhì)為2.5μg,優(yōu)點：試劑配制簡單，操作簡便快捷；迅速（2min）；敏感（較Lowry法高4倍）；結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定；所需蛋白質(zhì)量少（微克級）；干擾物質(zhì)少等優(yōu)點缺點：較高濃度SDS、Triton X-100等對其有干擾；

48、不同的純化蛋白質(zhì)間有可變性,3、BCA法,原理：在堿性的條件下，蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合，并將其還原Cu1+；Cu1+和BCA（bicinchoninic acid，二辛可酸）試劑反應(yīng)，使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍色復(fù)合物，該水溶性復(fù)合物在562nm處有強烈的光吸收，吸光度和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系 定量范圍：20μg/ml-200μg/ml，微量BCA測定范圍：0.5μg/ml-10μg/ml,優(yōu)點：操作比較簡單，采用

49、單一試劑4,4’-二羧2,2’-二喹啉(BCA)，終產(chǎn)物穩(wěn)定，抗試劑干擾能力較強；需時2h或過夜缺點：反應(yīng)時間長,原理：蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，在280nm處具有最大吸收，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系,4、紫外分光光度法,,用于原液比活性試算和成品規(guī)格控制測定范圍：0.1～0.5mg/ml；微管中最低可檢出0.1m1（0. 05mg）優(yōu)點：快速，直接測定不需要標(biāo)準

50、品，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定。缺點：不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的Pr無法檢測；樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾,原理：在定性分析的基礎(chǔ)上在，將S配成不同的標(biāo)準，繪制S濃度與峰高/峰面積相關(guān)的標(biāo)準曲線，再在相同條件下測T的峰高/峰面積，即可得T的濃度優(yōu)點：具有定量精確，靈敏度高，重復(fù)性好，自動化程度高等特點缺點：需要同種蛋白質(zhì)做標(biāo)準品,5、HPLC法/RP-HPLC法,6、生物檢定法,蛋白多肽類藥物

51、多為有生物活性的物質(zhì),且生物活性不僅取決于藥物的一級結(jié)構(gòu)，與二 、三級結(jié)構(gòu)亦密切相關(guān)，故生物檢定法是研究該類藥物動力學(xué)獨特而必需的方法生物檢定法有兩個目的，直接測定體液中藥物濃度及鑒定標(biāo)記藥物的生物活性在體分析：胰島素的小鼠血糖法離體組織（細胞）分析：縮宮素 的大鼠離體子宮法,SDS-PAGE-CBB G250染色-比色法：結(jié)合Lowry法等總蛋白質(zhì)含量的測定，可用于復(fù)雜的蛋白混合物中目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量測定ELISA法：為特異蛋白

52、含量測定方法，具有特異性強，靈敏度高，同時測定樣品多等特點，可用于生產(chǎn)過程中目標(biāo)蛋白質(zhì)含量的測定,7、免疫分析法,利用蛋白多肽藥物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢藥物，再以比色予以定量免疫分析法與生物檢定法具有一定的量效關(guān)系及相關(guān)性，提示它可部分地反映藥物的生物活性臨床藥動學(xué)領(lǐng)域，免疫法已逐漸取代生物檢定法,重組制品原液蛋白質(zhì)量少，純度高，可用Lowry法或Bradford法測定蛋白質(zhì)含量細胞因子蛋白含量正逐步采用

53、HPLC法，HPLC法測定蛋白質(zhì)含量能夠排除溶劑系統(tǒng)的干擾，特別適用于進行批與批之間的質(zhì)量控制,五、殘余雜質(zhì)檢測,（一）宿主相關(guān)雜質(zhì)1、宿主細胞蛋白(HCP)含量（Chp附錄ⅨC）樣品：原液、成品方法：雙抗體夾心法（用HAS作保護）宿主蛋白標(biāo)準品：中檢院提供標(biāo)準：大腸桿菌≤0.01%、CHO≤0.05%,2、宿主細胞DNA含量（Chp附錄ⅨB）,樣品：原料藥、制劑方法：DNA點印跡雜交法（地高辛標(biāo)記）DNA標(biāo)準品：廠家提供

54、標(biāo)準：DNA含量≤10ng/劑量,3、細胞內(nèi)毒素（Chp附錄ⅫE）,樣品：原液、成品方法：鱟試劑分析法鱟試劑標(biāo)準品：中檢院提供標(biāo)準：內(nèi)毒素含量≤10EU/劑量,工藝相關(guān)雜質(zhì)：殘余抗生素、蛋白A產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：多聚體、不同PEG修飾產(chǎn)物,六、安全性及其他檢查,1、無菌試驗：平皿法、需氧菌、厭氧菌、真菌、支原體2、熱原試驗：鱟試劑法或家兔法3、異常毒性試驗：小鼠（1ml）或豚鼠（5ml）腹腔注射4、水分、裝量、pH,第三節(jié)

55、應(yīng)用實例,一、鮭魚降鈣素,照（附錄1）鮭魚降鈣素生物檢定法測定。測定效價應(yīng)為標(biāo)示量的80％～125％，誤差可信限在64％～156％之間。本品的效價每毫克不得少于4000IU/mg。,1、含量（效價）測定,引起動物低血鈣反應(yīng)：本品的水溶液經(jīng)腹部皮下直接注射于大白鼠，可檢測到大鼠血鈣降低（附錄1）。薄層層析法：取本品供試品和鮭魚降鈣素標(biāo)準品，臨用前用0.1mol/L的醋酸溶液分別配成0.2%w/v的溶液。照薄層色譜法測試。 氨基酸檢查：

56、本品中的氨基酸應(yīng)含有以下“氨基酸組分分析項”中所列氨基酸， 不含天然氨基酸丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。,2、鑒別,紫外吸收光譜： 照紫外分光光度法測定，在250～280nm波長范圍內(nèi)掃描，應(yīng)在275±1nm波長處有最大吸收，按肽含量計算最大吸收度應(yīng)在0.40～0.55范圍，最大吸收度與254nm波長的吸收度比值不低于1.6。氯離子：照氯化物檢查法檢查，與5.0ml標(biāo)準氯化鈉溶液（10μg/ml）制成的溶液比較不得更深

57、（小于7％）。,3、檢查,4、有關(guān)物質(zhì),有關(guān)物質(zhì)：照（附錄VF）薄層層析法或電泳法測定有關(guān)物質(zhì)的含量不應(yīng)超過5％，供試品的次級斑點應(yīng)不得超過標(biāo)準品的次級斑點。 醋酸、水份含量及醋酸和水含量總和：本品為鮭魚降鈣素的醋酸鹽，產(chǎn)品中含有一定量的醋酸和水。,二、重組人胰島素,1、性狀,本品為白色或類白色的結(jié)晶性粉末。在水乙醇和乙醚中幾乎不溶，在稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液中易溶。,2、含量（效價）測定,HPLC法：照高效液相色譜法(附錄ⅤD)測定，

58、記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算小鼠血糖法：量反應(yīng)平行性法比活性大于27.5IU/mg,3、鑒別,HPLC法：在效價測定項下記錄的HPLC色譜圖中，供試品主峰的保留時間應(yīng)與重組人胰島素對照品峰保留時間一致。肽圖譜分析：V8酶水解供試品和對照品溶液。照效價測定項下的方法記錄HPLC色譜圖中，供試品的肽圖譜應(yīng)與對照品的肽圖譜一致。,人胰島素賴脯胰島素谷賴胰島素門冬胰島素甘精胰島素地神胰島素,4、檢查,純度：經(jīng)高效液相色譜（

59、SEC-HPLC）和SDS-PAGE檢測，純度大于99.0%。有關(guān)物質(zhì)：照效價測定項下的方法記錄色譜圖，按面積歸一化法計算，總有關(guān)物質(zhì)不得過3.0％。高分子蛋白質(zhì)：照高效液相色譜法(附錄ⅤD)測定，以胰島素單體-二聚體為對照品，以人胰島素單體和二聚體之間的峰谷高與二聚體峰高之比作為分離度，供試品溶液色譜圖中顯示的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，應(yīng)不得大于對照溶液主峰的峰面積(1.0％)。,細菌內(nèi)毒素：依(附錄Ⅺ E)采

60、用鱟試劑法檢查，每1mg重組人胰島素中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于10EU。宿主細胞蛋白：采用ELISA法測定，每1mg重組人胰島素中宿主細胞蛋白不得超過10ng。宿主細胞DNA:采用定量PCR法測定，每劑量重組人胰島素中宿主DNA不得超過10ng卡那霉素：采用ELISA法測定，重組人胰島素中卡那霉素不得超過10PPM。,鋅：照分光光度法（附錄Ⅳ A），在620nm的波長處分別測定吸收度，計算。含鋅量不得過1.0％。氯：照氮測定法（附錄Ⅶ