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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景: 卵巢癌是婦科腫瘤首位致死性疾病,晚期患者的5年生存率始終徘徊在15%~20%,腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成這一狀況的主要原因之一。鉑類(lèi)是治療卵巢癌的一線(xiàn)化療藥物,臨床卵巢癌對(duì)于鉑類(lèi)藥物耐藥已有明確的認(rèn)識(shí)和定義。然而,有關(guān)鉑類(lèi)耐藥機(jī)制的闡明卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。目前從基因水平對(duì)于腫瘤耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)已經(jīng)相對(duì)深入,但多數(shù)研究的結(jié)果表明,多種耐藥相關(guān)基因在卵巢癌中的表達(dá)并不能良好地預(yù)測(cè)腫瘤的耐藥和預(yù)后,mRNA的豐度與其相應(yīng)的
2、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)具有不一致性可能是主要的原因之一。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為從蛋白質(zhì)表達(dá)水平深入研究耐藥基因的功能提供了可能性。 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一項(xiàng)新興的實(shí)驗(yàn)技術(shù),廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域??傮w上看,該項(xiàng)研究技術(shù)主要包含以下幾個(gè)內(nèi)容:1.表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué);2.功能蛋白質(zhì)組學(xué);3.結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在卵巢腫瘤研究中的應(yīng)用主要集中于卵巢癌的早期診斷和篩選腫瘤標(biāo)志物等方面。從臨床組織入手直接研究鉑類(lèi)耐藥機(jī)制,存在異質(zhì)性、
3、影響因素復(fù)雜、陽(yáng)性結(jié)果易丟失等諸多困難。因此,以細(xì)胞系為研究對(duì)象,逐步延伸到臨床成為迄今研究耐藥機(jī)制的主要方法之一。 本研究旨在采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找卵巢癌耐藥相關(guān)候選蛋白。在誘導(dǎo)獲得分別耐受順鉑和卡鉑的人卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3和A2780的基礎(chǔ)上,首次采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)多個(gè)鉑類(lèi)敏感和耐藥的細(xì)胞系進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組分析,尋找耐藥相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。通過(guò)對(duì)候選蛋白的生物學(xué)和功能鑒定確認(rèn)其與鉑類(lèi)耐藥的相關(guān)性,并在臨床組織學(xué)標(biāo)本
4、中得到驗(yàn)證。進(jìn)一步對(duì)耐藥相關(guān)候選蛋白導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)耐藥的機(jī)制進(jìn)行探討。 研究方法: 1.分別采用順鉑大劑量沖擊和小劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)卵巢上皮癌鉑類(lèi)敏感細(xì)胞系SKOV3,建立順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80。獲得卵巢上皮癌鉑類(lèi)敏感及分別耐順鉑和卡鉑細(xì)胞系A(chǔ)2780,以及SKOV3耐卡鉑細(xì)胞系。分別檢測(cè)上述細(xì)胞的生物學(xué)特性、耐藥性、以及部分耐藥相關(guān)基因的表達(dá)。 2.分別提取上述各株鉑
5、類(lèi)敏感及耐藥細(xì)胞系的總蛋白質(zhì)。采用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE),考馬斯亮藍(lán)染色,圖像分析軟件分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,識(shí)別差異表達(dá)蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶切,基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定蛋白質(zhì)。定量PCR、Western blot法分別驗(yàn)證耐藥相關(guān)候選蛋白在各細(xì)胞系中mRNA水平、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。 3.利用基因工程技術(shù),分別構(gòu)建表達(dá)正義及反義耐藥相關(guān)候選蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各
6、細(xì)胞系,G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆,檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的生物學(xué)特性和耐藥性的改變。 4.分別將親本和轉(zhuǎn)染了正義耐藥相關(guān)候選蛋白質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi),比較順鉑腹腔化療對(duì)動(dòng)物體內(nèi)成瘤性的影響。 5.采用免疫組化的方法,分別檢測(cè)臨床卵巢癌對(duì)鉑類(lèi)化療敏感(n=21)和耐藥(n=21)患者的病理切片中耐藥相關(guān)候選蛋白的表達(dá)。利用等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn),分析化療敏感及耐藥患者候選蛋白表達(dá)量的差異。采用log-rank檢驗(yàn)分析
7、候選蛋白的表達(dá)與腫瘤無(wú)瘤生存期的關(guān)系。 6.耐藥機(jī)制的研究方法包括,MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)紫杉醇、表阿霉素的IC50和RI,以驗(yàn)證耐藥相關(guān)候選蛋白的特異性。通過(guò)免疫熒光法在激光共聚焦顯微鏡下觀察耐藥相關(guān)候選蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。采用電感偶合等離子質(zhì)譜檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的鉑含量和鉑-DNA的結(jié)合量。以Western blot法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的p53變化。利用超濾法濃縮細(xì)胞培養(yǎng)上清后,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞外耐藥相關(guān)候選蛋白的表
8、達(dá)。 研究結(jié)果: 1.歷時(shí)16個(gè)月誘導(dǎo)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞,SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的耐藥指數(shù)分別為4.1±2.0和11.5±3.2,小劑量間歇誘導(dǎo)法的耐藥指數(shù)高于大劑量沖擊誘導(dǎo)法。SKOV3/CDDP-80細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)和耐藥基因的表達(dá)均較SKOV3和SKOV3/CDDP-P有明顯不同。SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP的耐藥指數(shù)分別為3.0±0.2、3.5±0.8
9、、3.5±0.7。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有耐藥細(xì)胞的IC50和砌RI無(wú)明顯改變,耐藥性很穩(wěn)定。 2.發(fā)現(xiàn)卵巢癌耐藥細(xì)胞系與其親本細(xì)胞共有62個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn),利用MALDI-TOF-MS成功的鑒定了57個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。它們的功能分別與能量代謝、核苷酸代謝、氧化還原作用、分子伴侶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等相關(guān)。其中5種蛋白質(zhì)(Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1)在三種以上耐藥細(xì)胞中均差異表達(dá)。
10、Annexin A3和Destrin在全部耐藥標(biāo)本中表達(dá)均上調(diào),IDHc在四種耐藥細(xì)胞中均下調(diào);GST-omega 1除了在SKOV3/CBP中表達(dá)無(wú)改變外,在其余三種細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào);而Cofilin 1在SKOV3的兩種耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),在A2780的耐藥細(xì)胞中卻皆上調(diào)。 3.在上述五種共表達(dá)的差異候選蛋白質(zhì)中,Annexin A3蛋白的表達(dá)量差異最為顯著,在耐藥細(xì)胞中上調(diào)了3~20倍。經(jīng)過(guò)定量PCR、Western bl
11、ot法驗(yàn)證,Annexin A3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與比較蛋白質(zhì)組分析獲得了一致的結(jié)果,從而被最終確定為本研究的耐藥相關(guān)候選蛋白。 4.將正義Annexin.A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鉑類(lèi)敏感的細(xì)胞系后,耐藥指數(shù)上升2~4倍,生長(zhǎng)和增殖受到抑制。將反義Annexin A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鉑類(lèi)耐藥的細(xì)胞系后,耐藥指數(shù)下降2倍左右,生長(zhǎng)和增殖加快。細(xì)胞形態(tài)均無(wú)明顯改變。 5.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,給予順鉑化療后,與親本的SKOV3細(xì)胞相比
12、,轉(zhuǎn)染正義Annexin A3質(zhì)粒的細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)減慢,成瘤體積縮小,抑瘤率明顯降低。至觀察結(jié)束時(shí),SKOV3組移植瘤抑瘤率為(76.9±22.5)%,而SA4組移植瘤抑瘤率為(28.5±13.7)%,兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002)。 6.免疫組化染色比較化療敏感及耐藥患者腫瘤標(biāo)本中的Annexin A3表達(dá)量,U值=139,P值=0.035,具有明顯差異,Annexin A3在化療耐藥患者中的表達(dá)量明顯增高。比較無(wú)瘤生存期
13、,Annexin A3高表達(dá)患者平均11.3月(95%可信區(qū)間=4.0~18.0月);Annexin A3低表達(dá)者平均16.0月(95%可信區(qū)間=5.9~26.1月);二者具有顯著性差別(P值=0.012)。 7.轉(zhuǎn)染正義或反義Annexin A3質(zhì)粒的細(xì)胞對(duì)紫杉醇和表阿霉素的耐藥性均無(wú)明顯改變。在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均可檢測(cè)到Annexin A3的表達(dá)。在Annexin A3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞,胞漿內(nèi)鉑濃度明顯降低,與DNA結(jié)合的鉑明顯
14、減少,鉑的排出率明顯升高;經(jīng)CDDP作用后p53表達(dá)的增幅較小。在Annexin A3低表達(dá)的細(xì)胞,胞漿內(nèi)和與DNA結(jié)合的鉑濃度均明顯升高,CDDP作用后p53表達(dá)的增幅較大。Annexin A3可被分泌到細(xì)胞外,其分泌量隨著細(xì)胞內(nèi)Annexin A3表達(dá)的升高而增加;經(jīng)CDDP作用后可觀察到分泌量的增加。 結(jié)論: 1.兩種方式誘導(dǎo)卵巢上皮癌細(xì)胞系SKOV3均可獲得穩(wěn)定的鉑類(lèi)耐藥細(xì)胞系。大劑量沖擊誘導(dǎo)方式模擬臨床的化療過(guò)
15、程,但耐藥性的產(chǎn)生低于小劑量間歇誘導(dǎo)法,其耐藥指數(shù)可能更接近于機(jī)體內(nèi)情況。SKOV3細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)耐藥性的產(chǎn)生與已知鉑類(lèi)耐藥相關(guān)基因的表達(dá)不具有明顯的一致性。 2. 2-DE結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)可以有效地識(shí)別和鑒定卵巢癌化療敏感和耐藥細(xì)胞系之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。本研究共發(fā)現(xiàn)Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1等五種在三株以上耐藥細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),其功能涉及到多種生理代謝
16、和調(diào)節(jié)過(guò)程,提示卵巢癌對(duì)于鉑類(lèi)耐藥是多方面多途徑的。 3. Annexin A3蛋白在上述五種耐藥相關(guān)候選蛋白中以其在全部耐藥細(xì)胞系中的共表達(dá)、上調(diào)幅度明顯、同時(shí)獲得了mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的驗(yàn)證,被確定為本研究的目標(biāo)耐藥候選蛋白。 4.采用基因工程技術(shù)分別將正義或反義Annexin A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鉑類(lèi)敏感和耐藥細(xì)胞后,觀察到細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)耐藥性的相應(yīng)增加或減小,驗(yàn)證了Annexin A3蛋白與鉑類(lèi)耐藥的相關(guān)性。 5
17、.動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染了正義Annexin A3質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)后,與親本細(xì)胞組相比,腫瘤生長(zhǎng)減慢,成瘤體積縮小,移植瘤抑制率明顯降低,表明Annexin A3在動(dòng)物體內(nèi)仍能發(fā)揮其耐順鉑的作用。 6.免疫組化染色的結(jié)果顯示,Annexin A3在臨床化療耐藥患者中的表達(dá)量明顯增高;Annexin A3高表達(dá)患者的無(wú)瘤生存期明顯低于低表達(dá)者;從而在人體進(jìn)一步驗(yàn)證了Annexin A3是一種鉑類(lèi)耐藥相關(guān)蛋白。
18、 7.轉(zhuǎn)染正義Annexin A3質(zhì)粒的卵巢癌細(xì)胞對(duì)于順鉑和卡鉑的體外耐藥性均明顯增加,但對(duì)于紫杉醇和表阿霉素的耐藥性無(wú)明顯改變,提示Annexin A3可能是一種特異的鉑類(lèi)耐藥相關(guān)蛋白。這一蛋白可以定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核,其表達(dá)增強(qiáng)造成化療時(shí)細(xì)胞內(nèi)的鉑濃度降低,與DNA相結(jié)合的鉑減少,致使卵巢癌細(xì)胞p53活化程度降低,凋亡減少,細(xì)胞對(duì)于鉑類(lèi)化療耐受。本研究在細(xì)胞外檢測(cè)到Annexin A3的表達(dá),為進(jìn)一步在外周血尋找鉑類(lèi)耐藥標(biāo)記物打下
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