人子宮內(nèi)膜癌比較蛋白質(zhì)組學研究及癌相關(guān)蛋白Cyclophilin A的表達與功能驗證.pdf

1、目的：蛋白質(zhì)組學方法可高通量、整體性的反映組織或細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的變化，已成為目前研究癌癥發(fā)病機制、篩選腫瘤標記物、尋找藥物作用和基因干預靶點等的有力手段。本研究擬采用雙向電泳分離子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜組織的總蛋白質(zhì)，建立雙向電泳圖譜，尋找表達差異點，通過質(zhì)譜分析鑒定出癌相關(guān)蛋白候選分子。應用RT-PCR、westem Blot和免疫組化等方法在mRNA和蛋白質(zhì)水平對其表達差異進行驗證，并分析與子宮內(nèi)膜癌組織學分級、手術(shù)．病理分期等的

2、關(guān)聯(lián)性。應用RNA干擾技術(shù)對該基因在細胞增殖、凋亡等方面的生物學功能進行初步的探討。以期通過此研究，為進一步揭示子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制，尋找有意義的腫瘤標記物及基因干預的靶點，提供新的線索和思路。 方法：取8例子宮內(nèi)膜樣腺癌和8例增生期正常子宮內(nèi)膜組織標本，配對分為8組。提取組織總蛋白，通過雙向電泳技術(shù)分離總蛋白，并得到8組雙向電泳凝膠圖譜。通過PDQuest7.1.1軟件對圖像進行裁剪、斑點檢測和匹配分析，評價圖像的匹配率，并檢測

3、出表達差異點。將差異點切下后進行膠上原位酶解，然后通過基質(zhì)輔助激光解吸電離四極桿飛行時間質(zhì)譜(MALDI-Q-TOF MS/MS)及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索進行蛋白質(zhì)鑒定。在鑒定出的差異點中選擇表達恒定，差異明顯且穩(wěn)定，質(zhì)譜結(jié)果理想可靠的蛋白作為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白候選分子。采用RT-PCR和Western Blot方法對候選分子在子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜組織間的表達差異在mRNA和蛋白水平進行驗證。應用免疫組化方法檢測該蛋白在52例子宮內(nèi)膜樣腺

4、癌和39例增生期正常子宮內(nèi)膜、16例宮頸癌和10例正常宮頸上皮組織石蠟標本中的表達，對結(jié)果進行半定量打分和Imagepro.Plus5.0軟件測定IOD值，應用統(tǒng)計學方法對其在癌與正常組織間的表達差異性和與組織學分級、手術(shù)-病理分期的關(guān)聯(lián)性進行分析。應用RNA干擾技術(shù)，將針對靶基因的siRNA以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細胞，抑制靶基因RNA表達水平，通過MTT、流式細胞術(shù)、細胞克隆形成

5、實驗等方法檢測細胞增殖、凋亡，細胞周期等情況，對該基因的生物學功能進行初步的探討。 結(jié)果：得到8組分辨率高，重復性好的人子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜的雙向電泳圖譜，檢測的平均斑點數(shù)分別為782±28和760±33，各組內(nèi)兩張膠的匹配率(％)平均為85.625±4.2。共篩選出112個差異點，其中60個在癌組織中上調(diào)，52個下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索成功鑒定出99個蛋白，質(zhì)譜分析成功率達88.4％，其中21個蛋白質(zhì)譜結(jié)果理想，膠上差

6、異明顯，重復次數(shù)在4次以上。對鑒定出的差異蛋白進行了功能和細胞定位的分析和歸類，并確定cyclophilin A為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白候選分子。RT-PCR結(jié)果顯示癌組織中cyclophilinA基因與其受體CD147基因表達分別為正常組織的2.49倍(P<0.01)和3.69倍(P<0.01)。Western Blot結(jié)果顯示癌組織中cyclophilinA蛋白表達為正常組織的2.55倍(P<0.01)，具有顯著性差異，與蛋白質(zhì)組學結(jié)果

7、一致。免疫組化結(jié)果顯示該蛋白主要表達于胞漿及部分胞核。半定量積分法及圖像分析法顯示子宮內(nèi)膜癌組織表達顯著高于正常組織(P<0.01)；并且表達與組織病理學分級具有關(guān)聯(lián)性，隨組織分化程度降低，表達升高(P<0.01)；與手術(shù).病理分期無關(guān)聯(lián)性(P>0.05)。宮頸癌組織表達高于正常宮頸組織，同樣具有顯著性差異(P<0.01)。cyclophilin A-siRNA轉(zhuǎn)染HEC-1-B細胞可顯著抑制靶基因表達，抑制率達60％以上。轉(zhuǎn)染后細胞增

8、殖活性顯著下降，并隨濃度增加和時間延長而增加。100nM抑制效應最強，轉(zhuǎn)染后72小時抑制率可達52.4％(P<0.01)。克隆形成實驗顯示培養(yǎng)14天后轉(zhuǎn)染細胞克隆形成數(shù)目、克隆形成率等顯著低于未轉(zhuǎn)染細胞(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率顯著增加，72小時凋亡率(％)達45.7±3.1(P<0.01)，并伴有G<,0>/G<,1>期比例升高，S期比例下降等細胞周期變化。 結(jié)論：本研究采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)得到了子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜

9、組織的蛋白表達圖譜，篩選出112個表達差異點，并鑒定出其中99個蛋白，確定cyclophilin A為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白候選分子。通過RT-PCR、Western Blot和免疫組化等方法驗證了該蛋白在癌與正常組織的表達具有顯著性差異，并認為與組織病理學分級具有關(guān)聯(lián)性，與手術(shù)-病理分期無關(guān)聯(lián)性；對宮頸癌組織的檢測也得到類似結(jié)果。通過RNA干擾抑制cyclophilin A基因的表達，顯示該蛋白具有與促進增殖，抑制凋亡相關(guān)的生物學功能。本