毛皮動物犬瘟熱病毒分離鑒定及分子生物學特性研究.pdf

1、2015年6月至2016年6月，對山東省中東部地區(qū)送檢的118份病死水貂、貉子和狐貍肺臟病料檢測，水貂83份、貉子17份、狐貍18份。根據(jù)Genbank已發(fā)表犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV) N基因高度保守區(qū)域設計引物，建立了其RT-PCR檢測方法，陽性結果為71份、13份與13份，陽性率為85.54％、76.47%與72.22%。選取部分陽性病料經(jīng)MDCK細胞分離，貂源分離獲得4株CDV，貉源分離1株

2、，狐源沒有分離得到，5株分離株分別命名為 CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2與 CDV LC2株。接種細胞后部分樣品呈現(xiàn)明顯 CPE亦有部分樣品無明顯 CPE，經(jīng) RT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)部分無 CPE細胞凍融液檢測結果呈陽性，表明 CDV對 MDCK細胞的適應性有所不同。根據(jù) Genbank已發(fā)表的 CDV F、H與 N全基因序列分別設計擴增 F、H與N全基因的特異性引物，研究CDV分子生物學特性。采用RT-PCR

3、擴增及瓊脂凝膠回收、克隆，對克隆純化獲得的相關片段測序與分析。
　　經(jīng) DNAstar軟件對分離株核苷酸與氨基酸序列分析，根據(jù) Genbank中已發(fā)表的犬瘟熱毒株作參考株，構建遺傳進化樹分析。H基因核苷酸序列分析結果：CDV103、C DV114、CDV122、CDVDH2與CDVLC2株彼此同源性為90.7%-100.0%，CDVLC2與CDVDH2株的同源性最高100.0%，CDVLC2、CDVDH2株與CDV103、CDV1

4、14、CD V122株彼此間有相對較高同源性為90.7%-91.1%。H蛋白氨基酸序列潛在的 N-聯(lián)糖基化位點分析結果：CDV103、CDV114與 CDV122株糖基化位點均為9個；第309-311位糖基化位點為野毒株所獨有得，Asia-1型中部分毒株具有9個潛在 N-聯(lián)糖基化位點，CDVDH2與CDVLC2毒株糖基化位點位7個，這與Convac弱毒疫苗株H蛋白氨基酸序列的糖基化位點一致。H基因遺傳進化樹分析結果：CDV103、CDV

5、114與CDV122株屬于 Asia-1型，與 JN（08）（2009ChinaFJ810213fox）株有較近親緣關系；CD VDH2與 CDVLC2分離株屬于 America-1型，與 Convac、Onderstepoort疫苗株關系較近。
　　F基因核苷酸序列分析結果：CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2與 CDVLC2株核苷酸序列同源性為90.3%-99.0%，CDV103、CDV114與CDV122株

6、同Onderstepo ort疫苗株同源性為90.4%-90.7%，CDVDH2、CDVLC2株與 Onderstepoort疫苗株同源性最高為99.0%。Fsp推導氨基酸序列潛在 N-聯(lián)糖基化位點分析結果：CDV103、CDV114與CDV122株均含有2個潛在的N-聯(lián)糖基化位點，位于第62位和108位，CDV103、CDV114與 CDV122株糖基化位與 Asia-1型毒株一致。F基因構建遺傳進化樹分析結果：5株CDV劃分于2個基

7、因型，CDV103、CDV114與CDV122株屬于Asia-1型，與 ZYL（2016ChinaKX499865fox）株存在較近親緣關系；CDVDH2與 CDVLC2株屬于America-1型，同Onderstepoort疫苗株關系較近。
　　N基因核苷酸序列分析結果：CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2與CDVLC2株彼此間同源性均高于99.5%，為99.5%-100.0%，CDV103與CDV114株相似

8、性最高為100.0%，CDVLC2與CDVDH2株同源性最低為99.5%。N蛋白氨基酸序列存在較高同源性，5株分離株彼此同源性為99.0%-100.0%。與 Onderstepoort弱毒疫苗株相似性較高，為98.3%-98.9%；N基因遺傳進化樹分析結果：5株分離株與 Onderstepoort疫苗株存在較近親緣關系，劃分于America-1型。
　　本研究對山東省中東部地區(qū)毛皮動物犬瘟熱病毒流行病學調(diào)查，分離鑒定，主要基因測序