dna提取及pcr擴增實驗報告

1、PCR擴增及DNA瓊脂糖凝膠電泳劉琳1131428環(huán)境科學一、實驗目的一、實驗目的1學習并掌握PCR擴增的基本原理與實驗技術(shù)。2對擴增后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，并分析相應結(jié)果。二、實驗原理二、實驗原理1.PCR擴增多聚酶鏈反應（PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復制過程。在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA、四種脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱Taq聚合酶及兩個合成DNA的引物，而后加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變

2、性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（55℃）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應溫度升至中溫（72℃），在Tap酶作用下，用四種dNTP為原料，引物為復制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復，在同一反應體系中可重復高溫變性、低溫退火和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復合成，并在重復過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與

3、DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按指數(shù)方式擴增。經(jīng)過30～40個循環(huán)，DNA擴增即可完成。2.DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混

4、合物的目的。三、實驗材料三、實驗材料儀器：PCR擴增儀、0.2ul薄壁管、1.5ml離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試劑：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、兩種引物、16S全長DNA樣本、無菌ddH2O、模板DNA、TBE、瓊脂糖、EB、顯色劑。四、四、實驗步驟實驗步驟1.PCR擴增本次試驗選擇細菌16SrDNAV3區(qū)片段進行擴增。1.1根據(jù)計算，首先取1.5ml離心管按照2.5ul10B

5、uffer、1uldNTP、0.5ul341GC、0.5ul534、0.125ulTaq、19.375uddH2O的比例配置足量的PCR反應體系。1.2分別向9個薄壁管中分別加入24ul的反應體系，并分別添加8種不同的模版，并于第9個薄壁管中加入無菌ddH2O作為陰性對照。1.3將薄壁管放入PCR擴增儀中，按照預定程序進行PCR擴增。其中循環(huán)過程需要達到30~40次。程序如下：預變性：94℃3min循環(huán)：94℃變性30s55℃退火30s

6、72℃延伸30s末次延伸：72℃5min七、實驗收獲七、實驗收獲1.通過本次實驗學習并掌握了PCR反應的基本原理、實驗過程及技術(shù)。2.通過本次實驗掌握了電泳實驗分離DNA的原理和方法。八、思考題八、思考題1、如果你的研究中要擴增大腸桿菌某個酶的基因，你如何進行相關(guān)實驗？通過PCR擴增出想要的片段，然后通過凝膠電泳實驗進行回收，并與合適的載體連接，轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細胞。經(jīng)過培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進行酶切或PCR驗證，測序最終驗證，保存菌種2.一對引物

7、序列為5‘GACTCCAGTCGAATCTACCA3’和5‘AACCGTGGCGACACCGCTAA請計算它們的Tm值及選擇合適的退火溫度，如果按你算的退火溫度做PCR時沒有得到相應的產(chǎn)物，你怎么解決？5‘GACTCCAGTCGAATCTACCA3’Tm值=4（GC）2(AT)(5～10℃)=4（37）2（64）(5～10℃)=60℃(5～10℃)=50~55℃5‘AACCGTGGCGACACCGCTAA’Tm值=4（GC）2(AT)(

8、5～10℃)=4(57)2(62)(5～10℃)=64℃(5～10℃)=54~59℃因此退火溫度可以選擇在55℃可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會令引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)