海洋微生物多樣性及其研究方法

1、海洋細(xì)菌多樣性及其研究進(jìn)展,浩瀚的海洋是地球上生命的搖籃，它覆蓋地球表面積的70.8%。從海面到海底深層蘊(yùn)藏著數(shù)量驚人的生物、能源、礦產(chǎn)以及空間資源。目前的研究表明，海洋微生物不僅在海洋生態(tài)環(huán)境和物質(zhì)循環(huán)中具有極其重要的作用，也是各種新型生物活性物質(zhì)的潛在來(lái)源。由于世界面臨嚴(yán)重的資源、環(huán)境、人口問(wèn)題，海洋生物資源包括海洋微生物資源的開(kāi)發(fā)與多樣性研究已成為各沿海國(guó)家關(guān)注的熱點(diǎn)。,1914年，Issatchenko出版第一本海洋微生物

2、研究專(zhuān)著《北冰洋細(xì)菌的研究》，確定了海洋微生物學(xué)的研究方向，并使海洋微生物學(xué)發(fā)展成為獨(dú)立的學(xué)科。,Certes, A. 1884. On the culture, free from known sources of contamination, from waters and from sediments brought back by the expeditions of the Travailleur and the Talism

3、an: 1882-1883. C.R.Hebd.Séances Acad. Sci., 98:690-693,ZoBell,C.E. 1946. Marine Microbiology. Chronica Botanica, Waltham, MA.Johnson,T.W. et al. 1961. Fungi in Oceans and Estuaries(海灣）. Weinheim published by J.Cram

4、erWood,E.J.F. 1965. Marine Microbial Ecology. Chapman &Hall pressWood,E.J.F. 1967. Microbiology of Oceans and Estuaries. Elsevier Publishing, LondonColwell,R.R., et al. 1974. Effect of the Ocean Environment on Mic

5、robial Activities. University Park Press, Baltimore.Colwell,R.R., et al. 1975. Marine and Estuarine Microbiology Laboratory Manual. University Park Press, BaltimoreWood,E.J.F. 1975. The living ocean: Marine microbiolog

6、y. Croom HelmLitchfield,C.D. 1976. Marine Microbiology. Dowden,utchingon & Ross Inc.,Sieburth,J.McN. 1979. Sea Microbes. Oxford University PressVincent,W.F. 1988. Microbial Ecosystems of Antarctica. Cambridge Unive

7、rsity press, New YorkAustin,B. 1988. Marine Microbiology. Cambridge University PressBartlett,D.H. 2000. Molecular Marine Microbiology. Horizon Scientific pressKirchman, D.L. 2000. Microbial Ecology of the Oceans. Wile

8、y_Liss pressPaul,J.H. 2001. Marine Microbiology (Methods in Microbiolgy, volume 30) Academic PressSmith J. 2002. Microbiology of Marine & Freshwater Environments. Chapman & HallMunn,C.B. 2004. Marine Microbiol

9、ogy: Ecology and Application. BIOS Scientific Publishers,Hobbie,J.E. 1984. Heterotrophic Activity in the Sea (NATO conference series) Plenum Pub CorpVreeland,R.H. 1991. Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents（熱水口） (

10、Microbiology of Extreme and Unusual Environments). CRC PressKarl,D.M. 1995 The Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents (Crc Series on Microbiology of Extreme and Unusual Environments). Crc Pr I Llc

11、 。。。。。。,薛廷耀編. 海洋細(xì)菌學(xué). 科學(xué)出版社. 1962 北京克里斯 A E.著. 孫國(guó)玉，李世珍譯. 海洋微生物學(xué)（深海）. 科學(xué)出版社. 1964 北京 林永成， 周世寧主編. 海洋微生物及其代謝產(chǎn)物. 化學(xué)工業(yè)出版社. 2003 北京,海洋細(xì)菌的多樣性,摘自Martinko J M., et al. 1997, Brock Biology of Microorganisms（中譯本）,

12、生物系統(tǒng)發(fā)育,摘自Martinko J M., et al. 1997, Brock Biology of Microorganisms（中譯本）,細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育,微生物種類(lèi)多樣性,What is marine bacteria?,關(guān)于物種的概念,物種是一個(gè)可以相互交配繁殖的自然群體，并與其他群體在生殖上是隔離的（Mayr, 1969）；物種是一個(gè)具有自身進(jìn)化趨向和歷史結(jié)局的祖裔群體的單一譜系，并維持其特性與其他類(lèi)似譜系不同（Wil

13、ey, 1978）；微生物的種是一群具有高度表型相似的菌株的集合體，該菌株集合與其他類(lèi)群的菌株存在明顯差異（Stanier, 1986）；,species, units of evolution and ecology, should be considered as ecologically unique (e.g. different biotypes, virulence（至?。?properties, habitats,

14、 host ranges) ----from: Ward D.M., A natural species concept for prokaryotes. Curr Opin Microbiol 1998, 1:271-277,,Major horizontal zonation in an ocean profile. (Soruce: Odum1971.) Intertidal:潮間帶neritic淺海區(qū) eupho

15、tic zone 透光層 Aphotic zone無(wú)光層 Continental shelf大陸架 Continental slope大陸斜坡 Continental rise大陸隆 hadal zone深海帶(6000米以下)abyssal plain深海平原trench溝,,Principal environmental characteristics of an estuary.HWOST= high water line o

16、f spring tide; LWOST= low water line of spring tide.,,Thermal Vent Communities,Marine bacteria should exhibit growth at salinities between 20-40 parts per thousand. True marine bacteria will not grow in the absence o

17、f sodium chloride. Marine bacteria must be capable of growth at the low nutrient concentrations found in the oceans. Marine bacteria must be capable of growth at low temperatures.,海洋細(xì)菌種類(lèi)多樣性及其分布,古菌（ARCHAEA）嗜泉古菌界（Cr

18、enarchaeota）廣域古菌界（Euryarchaeota）初生古菌界（Korarchaeota）,真細(xì)菌（EUBACTERIA）變形細(xì)菌（Proteobacteria）-α、γ、β、δ、ε-subclass藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（Gram-positive bacteria）噬纖維菌屬-黃桿菌屬（Cytophaga-Flavobacterium）浮霉?fàn)罹≒lanctomyc

19、etales）疣微菌（Verrucomicrobiales）螺旋體（Spirochaeta）綠色非硫細(xì)菌（Green non-sulfur bacteria）,海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的部分Proteobacteria類(lèi)群的細(xì)菌,,海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的部分革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,海洋細(xì)菌基因資源多樣性,目前已克隆的來(lái)自海洋細(xì)菌的基因,海洋細(xì)菌的特性及其對(duì)多樣性研究的影響,海洋細(xì)菌的培養(yǎng)特性1 附著性和集結(jié)性2 生長(zhǎng)緩慢3 特殊的培

20、養(yǎng)要求4 存在活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable-but-nonculturable）,海洋細(xì)菌的形態(tài)和生理生化特性1 海洋微生物細(xì)胞形態(tài)的多變性2 生理生化反應(yīng)的多變性3 不易傳代和保存4 難以分類(lèi)鑒定,各種生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物占該生境微生物總數(shù)的比例,要判斷海洋環(huán)境中分離的微生物是海洋生物十分困難。盡管大部分在大海發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌與非海洋細(xì)菌有區(qū)別，但長(zhǎng)期以來(lái)，卻沒(méi)有一個(gè)確定的標(biāo)準(zhǔn)用于區(qū)別海洋的與非海洋的細(xì)菌，也沒(méi)有

21、對(duì)海洋細(xì)菌做出明確定義。,海洋細(xì)菌多樣性研究方法及其進(jìn)展,Beijerinck, M.W.(1889): How may one recover samples of water or sediment from the desired location and know that the samples are uncontaminated by the overlying water? How does one cult

22、ure these mysterious creatures? What are their requirements for growth ? Will they even grow in the laboratory at all? What kinds of microorganisms are there? Do they fit into the classical taxonomic schemes?,取樣的

23、方法1 海水樣品的采集 微生物采水器、錯(cuò)流過(guò)濾設(shè)備2 海洋沉積物的采集 底棲生物采泥器、shinkai6500、Kaiko,依賴(lài)微生物分離培養(yǎng)的研究方法 不依賴(lài)微生物分離培養(yǎng)的研究方法,海洋細(xì)菌多樣性研究方法,依賴(lài)微生物培養(yǎng)的研究方法1 海洋細(xì)菌的分離培養(yǎng)2 海洋細(xì)菌的分類(lèi)鑒定,特定海洋細(xì)菌類(lèi)群的分離方法,古菌、細(xì)菌和真核生物核糖體小亞基RNA基因序列的同源性（%）,16S rRNA基因（

24、16S rDNA）的特點(diǎn)1 存在于所有的生物細(xì)胞中，具有相似的結(jié)構(gòu)和功能2 具有分子計(jì)時(shí)器的特點(diǎn)，分子序列變化緩慢3 基因中存在進(jìn)化速率不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，交替分布，互不影響，可用于親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不同的生物之間的系統(tǒng)學(xué)研究,16S rRNA基因（16S rDNA）的結(jié)構(gòu)模式圖,通過(guò)比較不同微生物16S rDNA序列之間的差別，可能發(fā)現(xiàn)某種生物類(lèi)群相關(guān)的特征性核苷酸序列或突變，這些特征性核苷酸序列，為各種微生物資源的鑒定、分

25、類(lèi)建立起一個(gè)簡(jiǎn)單而統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。,大腸桿菌 r DNA小亞基二級(jí)結(jié)構(gòu)模式圖,不依賴(lài)微生物分離培養(yǎng)的研究方法顯微鏡直接檢查法脂肪酸分析基因序列分析探針雜交分析,脂肪酸分析 脂肪酸指紋圖譜是細(xì)菌分類(lèi)和鑒定中十分有用的技術(shù)，尤其是磷脂酸（phospholipid ester-linker fatty acid， PLFA），不同類(lèi)群的細(xì)菌具有特征性的磷脂酸組成，它們易于從土壤、沉積物等環(huán)境樣品的微生物細(xì)胞中抽提

26、出來(lái)，因此可用于評(píng)估自然環(huán)境包括海洋環(huán)境中活的微生物生物量或微生物種群結(jié)構(gòu). Gruntzig v., et al., 1985 FEMS Microbiol Ecol. 31:147-158,基因序列分析擴(kuò)增性rDNA限制性酶切片段多態(tài)性分析（ARDRA ）末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）變性（或溫度）梯度凝膠電泳（DGGE or TGGE）rDNA間隔區(qū)分析（RISA）熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

27、rRNA點(diǎn)/狹線(xiàn)印跡雜交（rRNA dot/slot blot ),海洋細(xì)菌多樣性研究中常用的基因分析技術(shù),基于核糖體RNA基因序列分析的流程,基因序列分析 由于核糖體RNA基因（rDNA）具有高度的保守性，在所有的細(xì)胞生物中都存在，且序列不受環(huán)境影響，從而成為迄今為止在細(xì)菌多樣性研究中應(yīng)用最多的核基因。 基本研究步驟：（1）環(huán)境樣品中總DNA的提取和純化；（2

28、）rDNA的PCR擴(kuò)增；（3）擴(kuò)增產(chǎn)物的克?。唬?）克隆產(chǎn)物的序列測(cè)定；（5）序列的比較分析和系統(tǒng)學(xué)研究。 Stahl D.A., et al. 1985 Appl Environ Microbiol. 49:1379-1384,海洋沉積物中DNA提取方法之比較,擴(kuò)增性rDNA限制性酶切片段多態(tài)性分析(Amplified Ribosomal DNA R

29、estriction Analysis，ARDRA) 將16S rDNA-PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的微生物多樣性研究技術(shù)；即采用識(shí)別4個(gè)堿基的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)克隆獲得的16S rDNA進(jìn)行酶切，通過(guò)電泳分析酶切后的片段長(zhǎng)度多態(tài)性。 Rooney-Vara J.N., et al. 1998 Syst Appl Mi

30、crobiol. 21:557-568,末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Termanal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP) 利用一定的標(biāo)記引物對(duì)樣品中DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增，然后進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切，檢測(cè)末端限制性片段的多態(tài)性。 Moesen

31、der M.M., et al. 1999 Appl Environ Microbiol. 65:3518-3525,變性梯度凝膠電泳技術(shù)(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 使用一對(duì)特異性引物PCR擴(kuò)增環(huán)境樣品中的16S rRNA基因，產(chǎn)生長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA片段混合物，該混合物在含梯度濃度變性劑（變性劑濃度

32、由低到高）的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，在一定溫度下，同一變性劑濃度下，序列不同的產(chǎn)物，其解鏈的溫度和程度不同，導(dǎo)致電泳的遷移率不同，從而將不同序列（只要有一個(gè)堿基的差別）的DNA分開(kāi)。 Benlloch S., et al. 2002 Environ Microbiol. 4(6):349-36

33、0,rDNA間隔區(qū)分析(rDNA internal spacer analysis，RISA) 利用16S rDNA 3’保守區(qū)和23S rDNA 5’保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增環(huán)境樣品中的16S-23 rDNA間隔區(qū)，通過(guò)分析該擴(kuò)增片段的核苷酸序列或比較其差異，進(jìn)行微生物多樣性研究。

34、 García-Martínez J. et al. 1999 J Microbiol Method 36:55-64,16S –23s rDNA間隔區(qū)示意圖,熒光原位雜交(Fluorescence in situ Hybridization, FISH) 將熒光標(biāo)記的具有屬種（或類(lèi)群）特異性的寡核苷酸探針與經(jīng)固定的環(huán)境樣品中的DNA或RNA進(jìn)行雜交，并通過(guò)掃描共聚

35、焦顯微鏡（scanning confocal laser microscopy， SCLM）檢測(cè)雜交信號(hào)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物的種群鑒定、種群數(shù)量分析及特異微生物跟蹤檢測(cè)。 Ravenschlag K., et al. 2000 Appl Environ Microbiol 66:3592-3602,用于海

36、洋細(xì)菌多樣性分析的探針1 基于不同的域、科、屬、種乃至亞種核糖體RNA基因（rDNA）設(shè)計(jì)的特異性探針2 針對(duì)海洋特有細(xì)菌類(lèi)群設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針3 針對(duì)某些特殊生理類(lèi)群細(xì)菌核糖體RNA或功能基因設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針,海洋特有細(xì)菌類(lèi)群的16S rDNA 探針,基因芯片技術(shù)在海洋細(xì)菌多樣性分析中的應(yīng)用,Eilers et al.（2000）：對(duì)德國(guó)北海浮游細(xì)菌的研究表明，培養(yǎng)獲得的兩個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群（Roseobacter和

37、Cytophaga-Flavobacterium）中，前者在16S rDNA克隆文庫(kù)中找到了相關(guān)序列，而后者沒(méi)有；Webster et al.（2001）：從海綿共生體中獲得的16S rDNA克隆文庫(kù)中，沒(méi)有序列與分離培養(yǎng)獲得的共生細(xì)菌16S rDNA序列相似；Acinas et al.（1999）：海水浮游細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)中優(yōu)勢(shì)類(lèi)群SAR86 cluster，目前沒(méi)有在任何可培養(yǎng)的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)；…… study（20

38、02）：南沙沉積物16S rDNA克隆文庫(kù)中，沒(méi)有序列與分離培養(yǎng)獲得的細(xì)菌16S rDNA序列相似,新 技 術(shù) ======> 新 發(fā) 現(xiàn),SAR11Giovannoni SJ., et al. 1990 Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton. Nature 345(6270):60-63Britschgi TB., Giovannoni SJ. 1991 Phy

39、logenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing. Appl Environ Microbiol 57(6):1707-1713Field KG., et al. 1997 Diversity and depth-spcecific distribution of SAR11 cl

40、uster rRNA genes from marine planktonic bacteria. Appl Environ Microbiol 63(1):63-70Connon SA., Giovannoni SJ. 2002 High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marin

41、e isolates. Appl Environ Microbiol 68(8):3878-3885Rappe MS., et al. 2002 Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade. Nature 418(6898):630-633Morris RM., et al. 2002 SAR11 clade dominates ocean su

42、rface bacterioplankton communities. Nature 420(6917):806-810,關(guān)于海洋細(xì)菌多樣性研究若干問(wèn)題的討論,Marine Microorganisms as a Biomedical Source: Are They Unculturable or Uncultured?,Uphoff et al.(2001) ：設(shè)計(jì)了12種不同的培養(yǎng)基，與12種不同的培養(yǎng)條件搭配對(duì)，對(duì)海洋浮游細(xì)

43、菌進(jìn)行研究，得到了屬γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、high-GC Gram-positives以及Cytophaga/Flavobacterium /Bacteroides等類(lèi)群的細(xì)菌；Eilers et al.（2000）：改進(jìn)培養(yǎng)方法，獲得一些海洋細(xì)菌，這些細(xì)菌的16S rDNA序列表明它們與西太平洋一類(lèi)尚未培養(yǎng)的細(xì)菌類(lèi)群NOR1一致；Eilers et al. （2001）：分離獲得了全球

44、分布的原來(lái)未獲培養(yǎng)的屬γ-Proteobacteria的NOR5細(xì)菌類(lèi)群；Webster et al.（2001）：應(yīng)用新的分離培養(yǎng)方法，從海綿中得到了與FISH的結(jié)果具有較大的一致性的共生細(xì)菌的類(lèi)群；Joulian et al.（2001）：培養(yǎng)獲得的硫酸鹽還原細(xì)菌與克隆文庫(kù)中部分序列所代表的屬種是一致的?！?,在對(duì)陸地環(huán)境細(xì)菌多樣性的比較研究中，來(lái)自克隆文庫(kù)的序列與從同樣生境中獲得的分離培養(yǎng)物16S rDNA序列往往具有較高

45、的相似性； 海洋細(xì)菌目前的不能培養(yǎng)，更多的原因在于人們對(duì)海洋細(xì)菌的認(rèn)識(shí)比之陸地微生物要缺乏得多；相信隨著了解的深入，它們是可以獲得培養(yǎng)的。,What is Marine Bacteria?,Gray et al. Appl Environ Microbiol. 1999,62(11): 4049-4059 (Puget Sound, Wash.),摘自Eilers et al. Appl Environ Mi

46、crobiol.2000 66(7):3044--3051,,來(lái)自海洋細(xì)菌16S rRNA基因特征性序列的發(fā)現(xiàn)，為我們從分子水平上界定海洋細(xì)菌提供了依據(jù)，隨著海洋細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富，人們將能夠進(jìn)一步建立用于判斷不同系統(tǒng)類(lèi)群、不同屬種海洋細(xì)菌的分子標(biāo)準(zhǔn)。,What is Next?,海洋細(xì)菌在海洋物質(zhì)循環(huán)乃至生命起源過(guò)程中的作用和意義 海洋細(xì)菌的代謝調(diào)控 特定生理類(lèi)群細(xì)菌的多樣性及其系統(tǒng)進(jìn)化