第5章 蛋白質的三維結構

1、,第五章 蛋白質的三維結構,在生物學條件下一種蛋白質占優(yōu)勢的構象只有一種（或少數幾種），它們是熱力學上最穩(wěn)定的，并且具有生物學活性，這種構象稱為天然蛋白質（native protein）。,第五章 蛋白質的三維結構,主要內容,研究蛋白質構象的方法穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力多肽主鏈折疊的空間限制蛋白質的二級結構纖維狀蛋白質超二級結構和結構域球狀蛋白質與三級結構亞基締合與四級結構蛋白質的變性與折疊,第五章 蛋白質的三維結構

2、,1、研究蛋白質構象的方法,X-射線衍射——蛋白質晶體核磁共振（NMR）——高濃度蛋白質溶液圓二色性、拉曼光譜、掃描隧道顯微鏡,第1節(jié) 研究蛋白質構象的方法,第二節(jié) 穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力,2、維持三維結構的作用力,a 離子鍵 b 氫鍵 c 疏水相互作用 d 范德華力 e 二硫鍵,第二節(jié) 穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力,天然蛋白質的穩(wěn)定性是相當脆弱的，生理條件下，折疊態(tài)和解折疊態(tài)之間的吉布斯自由能變化僅為65KJ/m

3、ol。疏水相互作用在穩(wěn)定蛋白質的構象方面起突出的作用,3、多肽主鏈折疊的空間限制3.1 肽鍵,一個多肽鏈的骨架是由通過肽鍵連接的重復單位N—Cα—C組成的。參與肽鍵形成的2個原子和另外4個取代成員：羰基氧原子、酰胺氫原子以及2個相鄰的α-碳原子，形成一個肽單位,第3節(jié)多肽主鏈折疊的空間限制,酰胺氮上的孤對電子與相鄰羰基之間具有共振作用，形成共振雜化體，穩(wěn)定性高。,肽鍵的特點： 1.肽鍵具有部分雙鍵性質： C-N單鍵

4、鍵長0.149nm C=N雙鍵鍵長0.127nm 肽鍵鍵長0.132nm 2.肽鍵不能自由旋轉，但N-C?和C?-C鍵都可以自由旋轉。 3.組成肽鍵的四個原子和與之相連的兩個?碳原子（C?）都處于同一個平面內，此剛性結構的平面叫肽平面或酰胺平面（amide plane）。 4.幾乎所有的肽單位處于反式構象，只有約6%的Pro殘基處于順勢構象。,第3節(jié)多肽主鏈折疊的空間限制,3.2、多肽主鏈折疊的空間限制,一個

5、蛋白質的構象取決于肽單位繞N-Cα和Cα-C鍵的旋轉，這些鍵連接著多肽鏈中的剛性的肽單位。繞N-Cα鍵旋轉的二面角稱φ，繞Cα-C鍵旋轉的稱ψ。,第3節(jié)多肽主鏈折疊的空間限制,當φ或ψ旋轉鍵所在的酰胺平面的取向二等分H-Cα-R平面，且該旋轉鍵兩側的主鏈處于順式構型時，規(guī)定φ=0°或ψ=0°,第3節(jié)多肽主鏈折疊的空間限制,從Cα沿鍵軸方向觀察，順時針旋轉的φ或ψ角度為正值，逆時針旋轉的為負值。二面角所規(guī)定的構象能否

6、存在，主要取決于兩個相鄰肽單位中非共價鍵合原子之間的接近有無障礙。,第3節(jié)多肽主鏈折疊的空間限制,拉氏構象圖,拉氏構象圖上的每一點對應于一對二面角（ φ或ψ ），代表一個Cα的兩個相鄰肽單位的構象。如果將一個蛋白質多肽鏈上所有C α的成對二面角都畫在圖上，那么蛋白質的主鏈構象將清楚的表現在圖上。圖中，陰影部分為允許區(qū)，空白部分為非允許區(qū)。,第3節(jié)多肽主鏈折疊的空間限制,4、蛋白質的二級結構,蛋白質的二級結構是指肽鏈的主鏈在空間的排列,

7、或規(guī)則的幾何走向、旋轉及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構象及鏈內或鏈間形成的氫鍵。常見的二級結構元件主要有?-螺旋、?-折疊、?-轉角、無規(guī)卷曲。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,4.1 α-螺旋,α-螺旋是蛋白質中最常見，最典型、含量最豐富的二級結構元件。1950年，L.Pauling預測出能夠穩(wěn)定存在的α-螺旋結構,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,α-螺旋的結構特點,多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉，形成螺旋結構，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺

8、距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；每個殘基繞軸旋轉100°，沿軸上升0.15nm;,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,肽鏈內形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個氨基酸殘基的N-H氫形成氫鍵。由氫鍵封閉的環(huán)是13元環(huán)。（因此，?-螺旋也稱3.613-螺旋）蛋白質中的?-螺旋幾乎都是右手螺旋。 ?-螺旋折疊過程中存在協(xié)同性。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,Make fists of your two

9、hands with thumbs outstretched and pointing straight up. Looking at your right hand, think of a helix spiraling up your right thumb in the direction in which the other four fingers are curled as shown (counterclockwise)

10、. The resulting helix is right-handed. Your left hand will demonstrate a lefthanded helix, which rotates in the clockwise direction as it spirals up your thumb.,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,a simple method for determining whether a hel

11、ical structure is right-handed or left-handed.,影響α-螺旋形成的因素,?-螺旋的形成及其穩(wěn)定性與其氨基酸組成和順序有關PolyAla生理條件下自發(fā)卷曲，形成?-螺旋（R小，不帶電荷）polyLys、PolyIle生理條件下不能形成?-螺旋（帶電荷、R較大）。多肽鏈中只要存在Pro， ?-螺旋即被中斷。（剛性環(huán)、不能形成氫鍵）,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,4.2、 ?-折疊,?-折疊也稱

12、?-結構或?-構象，它是蛋白質中第二種最常見的二級結構。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,?-折疊特點,?-折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的交聯，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。?-折疊有兩種類型：一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,4.3、 ?-轉角,肽鏈在某處回折180°所形成的結構

13、，由四個氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個氨基酸殘基的 -C=O 和第四個殘基的 –N-H 之間形成氫鍵，形成一個比較穩(wěn)定的環(huán)狀結構。?-轉角有兩種主要類型，它們之間的差別只是中央肽基旋轉了180°。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,?-轉角的特定構象取決于它的組成氨基酸。由于甘氨酸缺少側鏈，在?-轉角中能夠很好的調整其它殘基的空間阻礙，因此是立體化學上最合適的氨基酸。脯氨酸具有環(huán)狀的結構和固定的φ角，因此，一定程度上迫使?-轉

14、角形成，促進多肽鏈自身回折。這有助于反平行?-折疊片的形成。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,4.4、無規(guī)卷曲,泛指那些不能被歸入明確的二級結構如折疊片或螺旋的多肽片段。酶的功能部位常包含此構象。,第4節(jié) 蛋白質的二級結構,5、纖維狀蛋白質,纖維狀蛋白質(fibrous protein)廣泛地分布于脊椎和無脊椎動物體內，它是動物體的基本支架和外表保護成分，占脊椎動物體內蛋白質總量的一半或一半以上。這類蛋白質外形呈纖維狀或細棒狀，分子是有

15、規(guī)則的線型結構，這與其多肽鏈的有規(guī)則二級結構有關，而有規(guī)則的線型二級結構是它們的氨基酸順序的規(guī)則性反映。,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,纖維狀蛋白質的類型,纖維狀蛋白質可分為不溶性(硬蛋白)和可溶性兩類，前者有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白等；后者有肌球蛋白和纖維蛋白原等，但不包括微管(microtubule)和肌動蛋白細絲(actin filament)，它們是球狀蛋白質的長向聚集體(aggregate)。,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,?-角蛋白,角

16、蛋白廣泛存在于動物的皮膚及皮膚的衍生物，如毛發(fā)、甲、角、鱗和羽等，屬于結構蛋白。角蛋白中主要的是?-角蛋白。?-角蛋白主要由?-螺旋構象的多肽鏈組成。一般是由三條右手?-螺旋肽鏈形成一個原纖維（向左纏繞），原纖維的肽鏈之間有二硫鍵交聯以維持其穩(wěn)定性例如毛的纖維是由多個原纖維平行排列，并由氫鍵和二硫鍵作為交聯鍵將它們聚集成不溶性的蛋白質。?-角蛋白的伸縮性能很好，當?-角蛋白被過度拉伸時，則氫鍵被破壞而不能復原。此時?-角蛋白轉變成

17、?-折疊結構，稱為?-角蛋白。,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,毛發(fā)的結構,一根毛發(fā)周圍是一層鱗狀細胞，中間為皮層細胞。皮層細胞橫截面直徑約為20?m。在這些細胞中，大纖維沿軸向排列。所以一根毛發(fā)具有高度有序的結構。毛發(fā)性能就決定于?—螺旋結構以及這樣的組織方式,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,?-角蛋白,絲心蛋白(fibroin)：這是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質。絲心蛋白具有抗張強度高，質地柔軟的特性，但不能拉伸。絲心蛋白是典型的反平行式?-折疊片，多肽

18、鏈取鋸齒狀折疊構象。,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,絲蛋白是由伸展的肽鏈沿纖維軸平行排列成反向?-折疊結構。絲蛋白的肽鏈通常是由小側鏈的Gly，Ser，Ala組成，每隔一個殘基就是Gly。,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,膠原蛋白,天然的膠原是一個由3條具有左手螺旋的鏈相互纏繞形成右手超螺旋的分子。膠原的超螺旋結構是靠鏈間氫鍵以及螺旋和超螺旋的反向盤繞維持其穩(wěn)定性的。一個典型的膠原分子長300nm、直徑為1.5nm。在每一條左手螺旋

19、的膠原鏈內，每一圈螺旋需要3個氨基酸殘基，螺距為0.94nm，即每一個氨基酸殘基軸向距離為0.31nm。膠原中含有在其他蛋白中很少出現的羥脯氨酸（Hyp），序列-Gly-Pro-Hyp-常出現在膠原分子中。,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,第5節(jié) 纖維狀蛋白質,6、超二級結構和結構域,超二級結構指蛋白質中相鄰的二級結構單位（?-螺旋或?-折疊或?-轉角）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認的二級結構組合體。超二級結構的基本類

20、型：??、 ???、??,第6節(jié) 超二級結構和結構域,結構域：多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構的局部折疊區(qū)，它是獨立的緊密球狀實體。,第6節(jié) 超二級結構和結構域,結構域有時也稱功能域。一般說，功能域是蛋白質分子中能獨立存在的功能單位。功能域可以是一個結構域，也可以是兩個或以上結構域組成。,結構域之間通常只有一段柔性的肽鏈連接，形成所謂鉸鏈區(qū)，使結構域容易發(fā)生相對運動。,第6節(jié) 超二級結構和結構域,7、球狀蛋白質與三級結構

21、,蛋白質的三級結構(Tertiary Structure)是指多肽鏈在二級結構、超二級結構、結構域的基礎上，進一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側鏈構象在內的特征三維結構。,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,球狀蛋白質,球狀蛋白質可根據它們的結構域類型分為4大類：1、全α-結構蛋白質2、α,β-結構蛋白質3、全β-結構蛋白質4、富含金屬或二硫鍵蛋白質,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,全α-結構蛋白質,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,α,β-

22、結構蛋白質,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,全β-結構蛋白質,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,富含金屬或二硫鍵蛋白質,球狀蛋白質三維結構的特征,1、球狀蛋白質分子含有多種二級結構元件。2、球狀蛋白質三維結構具有明顯的折疊層次。3、球狀蛋白質是緊密的球狀或橢球狀實體。4、球狀蛋白質疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴露在分子表面。5、球狀蛋白質分子表面有空穴，這種空穴常是結合底物、效應物等配體并行使生物功能的活性部位。,第7節(jié) 球狀蛋白

23、質與三級結構,抗體的抗原結合部位,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,為什么在蛋白質二級結構與三級結構之間要加入一個“超二級結構”的概念呢？“超二級結構”與蛋白質三級結構之間的關系是什么呢？,超二級結構(super-secondary structure) = Motif = Folding unitsIn a chain-like biological molecule, such as a prote

24、in or nucleic acid, a structural motif （結構花式） is a three-dimensional structural element within the chain。Some motifs may be regarded as a combination of secondary structures, for example, the helix-turn-helix motif. Ot

25、her motifs, especially in proteins, consist of only a small number of amino acids or functional groups and do not depend on the secondary structure.Folding units describe similar spatial arrangements of regular seconda

26、ry structures in the proteins.,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,幾個概念：,Proteins with significant primary sequence similarity, and/or with demonstrably similar structure and function, are said to be in the same protein family. Two or more

27、families with little primary sequence similarity sometimes make use of the same major structural motif and have functional similarities; these families are grouped as superfamilies.,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,Protein tertiary struct

28、ure is more reliably conserved than primary sequence.,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,一個事實：,雖然發(fā)現的新蛋白質的數目逐年遞增，但發(fā)現的新的folds的量卻在顯著減少。,蛋白質的結構決定其功能。蛋白質家族、超家族體現的是蛋白質功能的相似性。結構花式是定義蛋白質家族、超家族的重要依據。對于蛋白質結構花式（折疊單元）的分類和比較將有助于更加清晰地發(fā)現新的功能關系。也有助于認識蛋白

29、個體或生物代謝途徑等的進化過程。為人類定向構造出新功能蛋白質提供線索。,第7節(jié) 球狀蛋白質與三級結構,8、蛋白質的四級結構,四級結構是指由兩 個或兩個以上具有三級結構的亞基按一定方式聚合而成的特定構象的蛋白質分子。通常亞基只有一條多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，這些多肽鏈間多以二硫鍵相連。亞基單獨存在時無生物學活性。 亦可以說，具有四級結構的蛋白屬于寡聚蛋白。（寡聚蛋白中亞基可以是相同的或不相同的，亞基相同時，分子具有對

30、稱性）實質：蛋白質的四級結構實際上研究亞基之間的相互作用、空間排布及亞基接觸部位的空間布局。,第8節(jié) 蛋白質的四級結構,維持蛋白質四級結構的主要作用力,在蛋白質四級結構中，亞基之間的作用力主要包括：氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水鍵。即亞基之間通過次級鍵彼此締合在一起（二硫鍵？）疏水鍵是最主要的作用力。,第8節(jié) 蛋白質的四級結構,四級結構對稱性,是四級結構蛋白主要性質之一，有旋轉對稱軸，如二聚體，四聚體。,第8節(jié) 蛋白質的四級結構,四

31、級締合在結構和功能上具有優(yōu)越性,可增強結構穩(wěn)定性;提高遺傳經濟性和效率，使編碼所需DNA減少;可使催化基團匯集在一起；具有協(xié)同性和別構效應。,第8節(jié) 蛋白質的四級結構,別構效應：多亞基蛋白質一般具有多個結合部位，結合在蛋白質分子的特定部位上的配體對該分子和其他部位所產生的影響（如改變親和力或催化能力）稱為別構效應。具有別構效應的蛋白質為別構蛋白質，酶稱為別構酶，具有調節(jié)代謝的功能。,第8節(jié) 蛋白質的四級結構,9、蛋白質的變性與折

32、疊,蛋白質精致的三維結構是怎樣獲得的？蛋白質的三維結構與一維的氨基酸序列信息之間是何關系？二十世紀五十年代，Christian Anfinsen 關于核糖核酸酶變性和復性的經典實驗揭示了氨基酸序列與蛋白質三維結構之間的關系。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,9.1 蛋白質的變性與復性,天然蛋白質分子受到某些物理因素如熱、紫外線照射、高壓和表面張力等或化學因素如有機溶劑、脲、胍、酸、堿等的影響時，生物活性喪失，溶解度降低，不對稱性增高以及其

33、他的物理化學常數發(fā)生改變，這種過程稱為蛋白質變性。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,蛋白質變性的實質是蛋白質分子中的次級鍵被破壞，引起天然構象解體。變性不涉及共價鍵（肽鍵）的破裂，一級結構仍保持完好。變性因素除去后，變性蛋白又可重新恢復到天然構象，這一現象稱為蛋白質的復性。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,9.2 核糖核酸酶的變性和復性試驗,變性：加8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍和巰基乙醇（還原二硫鍵），酶變性，緊密結構伸展成松散的無

34、規(guī)卷曲構象。復性：將尿素等變性劑和巰基乙醇用透析法除去，酶活性又可恢復，最后達原活性的95~100%。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,結論：氨基酸序列決定三級結構。問題：二硫鍵的形成是否決定三級結構？實驗：酶變性后，首先透析除去巰基乙醇，Cys氧化后，除去尿素，酶活性只恢復到原活性的1%。結論：二硫鍵只能在多肽鏈折疊成正確的結構之后形成。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,蛋白質的變性和復性是一個協(xié)調過程，在所加變性劑很窄的濃度范圍內，

35、或很窄的pH或溫度區(qū)間內突然發(fā)生。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,9.3、蛋白質的折疊可能是通過中間體的累進穩(wěn)定性（Progressive stabilization of intermediates）而非隨機組合,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,Consider a small protein with 100 residues. If each residue can assume three different conformation

36、s, the total number of structures would be 3100, which is equal to 5 × 1047. If it takes 10-13 s to convert one structure into another, the total search time would be 5 × 1047 × 10-13 s, which is equal to

37、5 × 1034 s, or 1.6 × 1027 years.,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,1040 of keystrokes to about 2800,the power of cumulative selection,9.4、分子伴侶（Chaperone）,伸展或部分折疊的蛋白質在高濃度時傾向于聚集，在體內蛋白質能在很稠的介質中高效發(fā)生的原因是因為分子伴侶的參與。分子伴侶包括大量不同的蛋白質家族，這些蛋白

38、質的功能包括幫助蛋白質的折疊和裝配，穩(wěn)定去折疊的蛋白質，對蛋白質去折疊以便轉運過膜或進入蛋白降解途徑等。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,分子伴侶的特性,分子伴侶通常與去折疊的或部分折疊的蛋白質相互作用。他們可以促進蛋白質正確折疊或穩(wěn)定非天然蛋白構象。它們不與天然蛋白相互作用，也不會成為折疊后蛋白結構的一個組成部分。分子伴侶對底物的特異性不同。分子伴侶協(xié)助蛋白質折疊的過程中需要與ATP的水解偶聯。在細胞脅迫（cell stress

39、）的情況下，分子伴侶的表達通常會增加。,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,Families Of Molecular Chaperones,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,Small heat shock proteins (hsp25) [holders]protect against cellular stressprevent aggregation in the lens (cataract)Hsp60 system (cpn60,

40、 GroEL) ATPase [(un)folders]protein foldingHsp70 system (DnaK, BiP) ATPase [(un)folders]stabilization of extended chainsmembrane translocationregulation of the heat shock response,第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,Hsp90 [holder]bindin

41、g and stabilization/regulation of steroid receptors, protein kinasesBuffer for genetic variation?Hsp100 (Clp) ATPase [unfolder]thermotolerance, proteolysis, resolubilization of aggregatesCalnexin, calreticulinglycop

42、rotein maturation in the ERquality controlFolding catalysts: PDI, PPI [folders]Prosequences: alpha-lytic protease, subtilisin (intramolecular chaperones) [folders],第9節(jié) 蛋白質的變性與折疊,本章涉及到的基本概念有哪些?真核細胞中HSP70蛋白的作用有哪些？,問題,,

43、一個學生根據試驗得出的下面數據而提出一種說法：即很多含有-S-S-鍵的蛋白質在空間結構形成的過程中，-S-S-鍵的形成是非隨機的。它將一系列含有二硫鍵的蛋白質在8 mol／L尿素(作為變性劑)存在下，用β-巰基乙醇處理以還原-S-S-鍵。這些試劑用適當的方法逐漸除去，以便使蛋白因二硫鍵的再形成而重新折疊。所得3種蛋白質經變性和再折疊后生物學活性的恢復數據如下：,(1)對于含4個-S-S-鍵的蛋白質，如果發(fā)生-S-S-的隨機再形成，生物學