微生物的遺傳變異和育種

1、第七章微生物的遺傳變異和育種,遺傳和變異是生物體最本質的屬性之一。在遺傳性適宜的環(huán)境條件下時，通過代謝和發(fā)育才能使其后代轉化為與親代相同的具體性狀。對微生物遺傳變異規(guī)律的深入研究，不僅促進了現(xiàn)代生物學的發(fā)展，而且還為微生物育種工作提供了豐富的理論基礎。,第一節(jié) 微生物的遺傳與變異概述,,遺傳性：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部遺傳因子即基因組所攜帶的遺傳信息。,表型：指某一生物個體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型

2、在合適環(huán)境條件下通過代謝和發(fā)育而得到的具體表現(xiàn)。,,變異：指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質結構或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。變化后的新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。,飾變：指外表的修飾性改變，即一種不涉及遺傳物質結構改變而只發(fā)生在轉錄、轉譯水平上的表型變化。飾變是不遺傳的。,,例如，粘質沙雷氏菌，在25℃下培養(yǎng)時，會產(chǎn)生一種深紅色的靈桿菌素，把菌落染成似鮮血那樣。可是，當培養(yǎng)在37℃下時，群體中所有細胞都不產(chǎn)色素。如果重新降

3、溫至25℃，產(chǎn)色素能力又得到恢復。只有遺傳型的改變，即生物體遺傳物質結構上發(fā)生的變化，才稱為變異。,第二節(jié) 遺傳變異的物質基礎,（一）、核酸－－遺傳變異的物質基礎（3個經(jīng)典實驗）,1、經(jīng)典轉化實驗,Griffith是第一個發(fā)現(xiàn)轉化現(xiàn)象的 ，雖然當時還不知道稱之為轉化因子的本質是什么，但是他的工作為后來Avery等人進一步揭示轉化因子的實質，確立DNA為遺傳物質奠定了重要基礎。,結論,活的、非致病性的R型從已被殺死的SⅢ型中獲得了遺傳物

4、質，使其產(chǎn)生膜成為致病性的SⅢ型。Griffith將這種現(xiàn)象稱為轉化(transformation),2、噬菌體感染實驗,1952年，Hershey和Chase證實了DNA是噬菌體的遺傳物質基礎的著名實驗。,T2噬菌體的實驗,3、植物病毒重建實驗,1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的煙草花葉病毒進行了病毒重建實驗，證實了RNA是遺傳物質。,(1)用表面活性劑處理標準TMV，得到它的蛋白質；(2)從TMV的變種HR通

5、過弱堿處理得到它的RNA；(3)通過重建獲得雜種病毒；(4)證實雜種病毒的蛋白質外殼是來自TMV標準株。(5)雜種病毒感染煙草產(chǎn)生HR所特有的病斑，說明雜種病毒的感染特性是由HR的RNA 所決定，而不是二者的融合特征(6)從病斑中一再分離得到的子病毒的蛋白質外殼是HR蛋白質，而不是標準株的蛋白質外殼。以上實驗結果說明雜種病毒的感染特征和蛋白質的特性 是由它的RNA所決定，而不是由蛋白質所決定，遺傳物質是RNA。,（二）、核酸的結

6、構與復制,1、DNA的結構,（A、T、C、G）,,2、RNA的結構,,（A、U、C、G）,3、核酸的復制－－半保留復制,真核微生物的核內(nèi)DNA與組蛋白結合成為染色體。原核微生物的DNA不與蛋白質結合，呈松散的核質體狀態(tài)存在。,（三）、遺傳物質在細胞內(nèi)存在的方式,遺傳性變異是由基因結構發(fā)生改變所致，主要通過基因突變、基因損傷后的修復、基因的轉移與重組來實現(xiàn)。,第三節(jié) 基因突變和誘變育種,基因突變 又稱點突變， DNA鏈上的一對

7、 突變 或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變。 (堿 基置換 、移碼突變 ) 染色體畸變 DNA的大段變化(損傷)現(xiàn)象 (添加、缺失、易位、倒位 ) 基因重組：把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉移

8、 到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后， 形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重 組(原核生物、真核生物),,,遺傳性變異,（一）基因突變的類型,1、營養(yǎng)缺陷型 2、抗性突變型 3、條件致死突變型 4、形態(tài)突變型 5、抗原突變型 6、其他突變型 如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)

9、量以及對某種藥物的依賴性突變型等。,一、基因突變,（二）基因突變的特點(7個特點),1 不對應性2 自發(fā)性3 稀有性4 獨立性5 誘變性6 穩(wěn)定性7 可逆性,1、不對應性,即突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應關系。 例如，細菌在有青霉素的環(huán)境下，出現(xiàn)了抗青霉素的突變體；在紫外線的作用下，出現(xiàn)了抗紫外線的突變體；在較高的培養(yǎng)溫度下，出現(xiàn)了耐高溫的突變體等。表面上看來，會認為正是由于青霉素、紫外線或高溫的"

10、;誘變"，才產(chǎn)生了相對應的突變性狀。事實恰恰相反，這類性狀都可通過自發(fā)的或其任何誘變因子誘發(fā)而行。這里的青霉素、紫外線或高僅是起著淘汰原有非突變型(敏感型)個體的作用。,2、自發(fā)性,各種性狀的突變，可以在沒有人為的誘變因素處理下自發(fā)地發(fā)生。 "自發(fā)突變"決不意味著這種突變是沒有原因的，而只是說明人們對它們還沒有很好認識而已。,3、稀有性,自發(fā)突變雖可隨時發(fā)生，但突變的頻率是較低和穩(wěn)定的，一般在10-6~10

11、-9間。所謂突變率，一般指每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的機率。例如，突變率為1×10-8者，就意味著當10 8個細胞群體分裂成2×10 8個細胞時，平均會形成一個突變體。,4、獨立性,突變的發(fā)生一般是獨立的，即在某一群體中，既可發(fā)生抗青霉素的突變型，也可發(fā)生抗鏈霉素或任何其他藥物的抗藥性，而且還可發(fā)生其他不屬抗藥性的任何突變。某一基因的突變，既不提高也不降低其他基因的突變率。,5、誘變性,通過誘變劑的作用，可

12、提高自發(fā)突變的頻率，一般可提高10-10 5倍。不論是自發(fā)突變或誘發(fā)突變(誘變)得到的突變型，它們之間并無本質上的差別，因為誘變劑僅起著提高突變率的作用。,6、穩(wěn)定性,由于突變的根源是遺傳物質結構上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，所以產(chǎn)生的新性狀也是穩(wěn)定的、可遺傳的。,7、可逆性,由原始的野生型基因變異為突變型基因的過程，稱為正向突變，相反的過程則稱為回復突變或回變。實驗證明，任何性狀既有正向突變，也可發(fā)生回復突變。,（三） 基因突變自發(fā)性和不對應性

13、的實驗證明,1、Luria等的變量試驗（彷徨實驗）2、Newcombe的涂布試驗3、Lederberg等的影印平板培養(yǎng)法,彷徨試驗(fluctuation test),影印試驗(replica plating),1、物理誘變：紫外線、X射線等紫外線誘變機制輻射劑量光復活作用,二、誘變與育種,,2、化學誘變： 誘變劑： 亞硝酸、硫酸二乙酯、亞硝基胍等 誘變機制 注意事項： 選擇適宜的

14、誘變劑及劑量，適當?shù)臏囟?和PH，終止反應，安全,基因突變及其機制,(一) 自發(fā)突變與育種1、從生產(chǎn)實踐中選育 選育步驟 (1)采樣 (2)加富培養(yǎng) (3)平板分離 (4)性能測定,三、突變與育種,定向培育一般是指用某一特定環(huán)境長期處理某一微生物培養(yǎng)物(群體)，同時不斷對它們進行移種傳代，以達到積累和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。

15、由于自發(fā)突變的頻率較低，變異程度較輕微，所以培育新種的過程一般十分緩慢。與誘變育種、雜交育種和基因工程技術相比，定向培育法帶有守株待兔的被動狀態(tài)。 例如，異煙肼是吡哆醇的代謝拮抗物(即結構類似物)，兩者分子結構類似。,2 、定向培育優(yōu)良菌種,(二) 誘變育種,誘變育種就是利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變頻率大幅度提高，然后設法采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的突變株，以供生產(chǎn)實踐或

16、科學實驗之用。 誘變育種除提高產(chǎn)量外，還可改進產(chǎn)品質量、擴大品種和簡化工藝等目的。它具有方法簡便、工作速度快和收效顯著等優(yōu)點，仍是目前最廣泛使用的育種手段。,1、誘變育種的基本環(huán)節(jié),1、初篩：以量為主2、復篩：以質為主,2、誘變育種的步驟,3、營養(yǎng)缺陷型的篩選,營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)是指通過誘變而產(chǎn)生的，在一些營養(yǎng)物質(如氨基酸、維生至少和堿基等)的合成能力上出現(xiàn)缺陷，因此必須在基本培養(yǎng)基(minimal

17、 medium)中加入相應的有機營養(yǎng)成分才能正常生長的變異菌株。野生型是指從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生人為營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。在其相應的基本培養(yǎng)基上生長。,基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基,,,與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關的3類培養(yǎng)基：,篩選營養(yǎng)缺陷型菌株4個環(huán)節(jié)：,(1)誘變劑處理 (2)淘汰野生型 (3)檢出缺陷型 (4)鑒定缺陷型,4、誘變育種工作中的幾個原則,(1)選擇簡便有效的誘變劑 目前在實踐上

18、常用的誘變劑主要有紫外線(u.v.)、氮芥、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG或MNNG)和亞硝基甲脲(NMU)等。后兩種因為有突出的誘變效果，所以被譽為“超誘變劑”。 (2)挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株,(4)選用最適劑量要確定一個合適的劑量，常常要經(jīng)過多次試驗。就一般微生物而言，誘變率往往隨劑量的增高而提高，但達到一定劑量后，再提高劑量反而會使誘率下降。根據(jù)對紫外線、X射線和乙烯亞胺等誘變效應的研究結果，發(fā)現(xiàn)正變轉

19、多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負變較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負變。因此，在誘變育種工作中，目前比較傾向于采用較低的劑量。,,,(5)利用復合處理的協(xié)同效應 誘變劑的復合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應，這對育種實踐是很有參考價值的。 (6)利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關指標 為了確切地了解某一突變株產(chǎn)量性狀的提高程度，必須進行大量的分析測定和統(tǒng)計工作。,,,(7)設計和采用高效篩選

20、方案和方法 通過誘變處理，在微生物群體中會出現(xiàn)種種突變型個體，絕大多數(shù)是負變體，要在其中把極個別的產(chǎn)量提高較顯著的正變體篩選到手，就要求采用效率較高的科學篩選方案和方法。篩選過程以分初篩與復篩兩階段進行為好。前者以量(選留菌株的數(shù)量)為主，后者以質(測定數(shù)據(jù)的精確度)為主。,,,第四節(jié) 基因重組,凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組。重組可使生物體在未發(fā)生突變的情

21、況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。 重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質分子水平上的雜交。,,真核微生物中的有性雜交、準性雜交及原核生物中的轉化、轉導、接合和原生質體融合等都是基因重組在細胞水平上的反映?；蛑亟M是雜交育種的理論基礎。由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，因此不論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進了一大步。,,,(一)接合,通過供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的

22、過程，稱為接合(有時也稱"雜交")。,一、原核微生物的基因重組,接合：是細菌通過性菌毛相互連接溝通，將遺傳物質（主要是質粒DNA）從供體菌轉移給受體菌。能通過結合方式轉移的質粒稱為接合性質粒，不能通過性菌毛在細菌間轉移的質粒為非接合性質粒。,,,受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉化。,(二)轉化,(三) 轉導,通過缺陷噬菌體的媒介，把

23、供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得了前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉導。 根據(jù)轉導基因片段的范圍，可將轉導分為兩類：普遍性轉導（轉導的DNA可是供菌染色體上的任何部分）、局限性轉導（轉導的DNA只限供菌染色體上的特定基因）。,普遍性轉導( generalized transduction),(四)原生質體融合,通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程，稱為原生質體融合或細胞融

24、合。,原生質體融合的一般原理和主要過程,先準備兩個有選擇性遺傳標記的突變株，在高滲溶液中，用適當?shù)拿摫诿?如細菌可用溶菌酶或青霉素處理，入線菌可用溶菌酶或相應的脫壁權衡利弊，真菌可用蝸牛酶或相應的脫壁酶等)去除細胞壁，再將形成的原生質體離心聚集，并加入促融合劑PEG(聚乙二醇)促進融合，然后在高滲溶液中稀釋，涂在能使其再生細胞壁 或進行分裂的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過影印接種法，將其接種到各種選擇性培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否是重組子,

25、,（一）有性雜交（二）準性雜交菌絲聯(lián)結異核體的形成形成雙倍體分離子的產(chǎn)生,二、真核微生物的雜交育種,目的基因（即外源基因或供體基因）的取得載體系統(tǒng)的選擇，目的基因與載體重組體的構建，重組載體導入受體細胞，工程菌或工程細胞株的表達、檢測以及實驗室和一系列生產(chǎn)性試驗等。,第五節(jié) 基因工程,基本操作包括：,,基因工程的應用,在生產(chǎn)多肽類藥物、疫苗中的應用改造傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌種動、植物特性的基因工程改良基因工程在環(huán)境保護