微生物遺傳變異與育種

1、第七章 微生物的遺傳變異與育種,學習目標：1.掌握生物體的遺傳物質(zhì)及存在水平；2.理解質(zhì)粒的概念，了解常見的質(zhì)粒；3.理解基因突變的概念、類型與特點；4.了解菌種衰退的防止方法與復壯方法；5.了解菌種保藏的原理與常見保藏方法。,1、理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應(yīng)符合以下要求：,①遺傳性狀穩(wěn)定；②生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；③目標產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率；④目標產(chǎn)物最好能分泌到細胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利于分離；

2、⑤盡可能減少產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量，以提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量并利于分離；⑥培養(yǎng)基成分簡單、來源廣、價格低廉；⑦對溫度、pH、離子強度、剪切力等環(huán)境因素不敏感；⑧對溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。,微生物是研究現(xiàn)代遺傳學和其它許多主要的生物學基本理論問題中最熱衷的研究對象。 對微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進了現(xiàn)代分子生物學和生物工程學的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效

3、、從隨機到定向、從近緣雜交到遠緣雜交的方向發(fā)展。,2、研究微生物遺傳學的意義,3、遺傳與變異的概念,遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。特點：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和；是一種內(nèi)在可能性或潛力。 遺傳型 + 環(huán)境條件

4、 表型表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;------是一種現(xiàn)實存在，是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。,變異(variation):生物體在外因或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變。變異的特點：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.形狀變化的幅度大；c. 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modif

5、ication）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點是：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度小；c.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復。,第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（transformation） F.Griffith，肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗。（二）噬菌體感染實驗（三）植物病毒的重建實驗,一、證明核

6、酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個經(jīng)典實驗,核酸存在的七個水平細胞水平：存在于細胞核或核質(zhì)體，單核或多核細胞核水平: 原與真核生物的細胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平: 倍性(真核)和染色體數(shù)。核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復合或裸露，雙鏈或單鏈?；蛩剑壕咦灾鲝椭颇芰Φ倪z傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平：信息單位,起始和終止,核苷酸水平：突變或

7、交換單位，四種堿基。,二、遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的存在部位和方式,三、原核生物的質(zhì)粒,1、質(zhì)?；A(chǔ)知識定義：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子，能獨立于細胞核進行自主復制。大?。杭s為2-100×106Dalton，上面攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。,性質(zhì)：①可以在細胞質(zhì)中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體的形式存在；②質(zhì)粒是一種復制子，根據(jù)自我復制能力的不同，可把質(zhì)粒復制的控制形

8、式分為嚴緊型和松弛型兩種。 ③可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或接合作用而由一個細菌細胞轉(zhuǎn)移到另一個菌細胞中，使兩個細胞都成為帶有質(zhì)粒的細胞；質(zhì)?？梢詥为氜D(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。④對于細菌的生存并不是必要的。⑤功能多樣化。,功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。存在范圍：很多細菌如E.coli、lac

9、tis、根癌土壤桿菌等。制備：包括增殖、裂解細胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法,2、幾種代表性質(zhì)粒,（1）F-因子：又稱致育因子或性因子。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中，決定性別。（2）R因子：即抗性轉(zhuǎn)移因子和抗性決定R因子。其上帶有其它抗生素的抗性基因，也稱耐藥性質(zhì)粒。該因子首先是在志賀氏菌中發(fā)現(xiàn)。,（3）Ti

10、質(zhì)粒：即誘癌質(zhì)粒。存在于根癌土壤桿菌中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當前，Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。（4） Col因子：產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細菌素，能通過抑制復制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細菌。 凡帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。,（5）降解性質(zhì)粒：只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)?？?/p>

11、為一系列能降解復雜物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名。（6）巨大質(zhì)粒：是近年來在根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為200-300×106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。,第二節(jié) 基因突變,突變（mutation）：指生物體表型突然發(fā)生的可遺傳變化。 染色體畸變——細胞學上可以看到染色體的變化。 突變

12、 包括：①缺失②添加（重復、插入）③易位④倒位 。 基因突變——細胞學上看不到遺傳物質(zhì)的變化。 包括：①堿基置換（轉(zhuǎn)換、巔換）； ②移碼突變（缺失、添加） 。突變體：發(fā)生了突變的微生物細胞或菌株野生型：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株。,,,★依表型的改變分為：形態(tài)突變型——營養(yǎng)缺陷型——因突變而

13、喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型。發(fā)酵突變型——喪失產(chǎn)生某種生物合成酶能力的突變型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性。條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型?？乖蛔冃汀蛲蛔兌鸬目乖Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變。產(chǎn)量突變型——,一、基因突變的類型,★依突變發(fā)生方式分為： 1、自發(fā)突變：環(huán)境因素的影響，

14、DNA復制過程的偶然錯誤等而導致。一般頻率較低，通常為106-109 。2、誘變：某些物理、化學因素對生物體的DNA進行直接作用，突變以較高的頻率產(chǎn)生。這些理化因素稱為誘變劑。,★按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selective mutant）：具有選擇標記（如營養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-

15、selective mutant）：無選擇標記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。,二、突變的特點,適用于整個生物界，以細菌的抗藥性為例。不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。可逆

16、性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變，從突變株回到野生型的過程則稱為回復突變 或回變。,三、基因突變的機制,本部分內(nèi)容課內(nèi)不進行介紹，有興趣可以自學。P111.,第三節(jié) 基因重組,凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組（gene recombination）或遺傳重組，簡稱重組。 重組可使生物體在未發(fā)生

17、突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。 重組與雜交的關(guān)系：重組是分子水平上的一個概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交。而一般所說的雜交則是細胞水平上的一個概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。,一、原核微生物的基因重組,基因重組的方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導接合原生質(zhì)體融合,,R型活菌+S型死菌→ →S型活菌定義：受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組

18、中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。有關(guān)名詞：受體菌：recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者供體菌：donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者轉(zhuǎn)化因子：來自供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)化子：transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進入自身染色體組的重組子,（一）轉(zhuǎn)化（transformation）,1、轉(zhuǎn)化,,①受體細胞要處于感受態(tài).感受態(tài)：competenc

19、e，受體細胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)②供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1× 107 D 左右 ③菌株間的親緣關(guān)系密切,2、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件,3、轉(zhuǎn)化的類型,根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：①自然遺傳轉(zhuǎn)化②人工轉(zhuǎn)化,（二）轉(zhuǎn)導（transduction）,細菌細胞間進行遺傳交換的另一種方式，指通過缺陷噬菌體的媒介，將供體細胞的小片段DNA攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者

20、獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。,1.轉(zhuǎn)導,轉(zhuǎn)導子：由轉(zhuǎn)導作用獲得部分新性狀的重組細胞。轉(zhuǎn)導噬菌體：能將一個宿主（細菌）的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個宿主（細菌）的噬菌體。,2.轉(zhuǎn)導的種類,普遍轉(zhuǎn)導（generalized transduction）：通過少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段進行“誤包”而將其遺傳性狀轉(zhuǎn)移給受體菌的現(xiàn)象。 局限性轉(zhuǎn)導：也稱局限轉(zhuǎn)導，指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中

21、，并與后者的基因整合、重組形成轉(zhuǎn)導子的現(xiàn)象。 溶源轉(zhuǎn)變：當溫和噬菌體感染宿主而使其發(fā)生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主的核基因組上，而使后者獲得了除免疫性以外的新性狀的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變。,（三）接合（conjugation）,定義：供體菌（“雄”）通過其性菌毛與受體菌（“雌”）相接觸，前者傳遞不同長度的DNA給后者，并在后者細胞中進行雙鏈化或進一步與核染色體發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合

22、而獲得新性狀的受體細胞就是接合子（conjugant）存在范圍：細菌：G – 較為多見如E. coli等最為常見。放線菌：Streptomyces 、Nocardia。接合還可發(fā)生在不同屬的菌種之間。E. coli的F因子：決定性別的質(zhì)粒，屬于附加體（episome），可以通過接合作用獲得，也可以通過丫啶類化合物、溴化乙錠或絲裂霉素C的處理而消除。,,（四）原生質(zhì)體融合——protoplast fusion,概念：通過人為方法

23、，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的遺傳性穩(wěn)定的融合子（fusant）的過程，稱為原生質(zhì)體融合。適用范圍：各種生物細胞都能進行原生質(zhì)體融合，包括各種原核生物、真核微生物以及高等動植物和人體的不同細胞。意義：70年代后發(fā)展的一種育種新技術(shù)，繼轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導和接合之后一種更有效的轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的手段。原生質(zhì)體融合不僅能在不同菌株或種間進行，還能做到屬間、科間甚至更遠緣的微生物或高等生物細胞間的

24、融合。,原生質(zhì)體融合的優(yōu)點： 可以提高重組率 雙親可以少帶標記或不帶標記 可進行多親本融合 有利于不同種間、屬間微生物的雜交 通過原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量 發(fā)展點：有關(guān)原生質(zhì)體融合的遺傳機制，尚未研究清楚，目前還在探索中。,二、真核微生物的基因重組,主要方式：有性雜交準性雜交原生質(zhì)體融合（略）轉(zhuǎn)化（略）,（一）有性雜交 一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，

25、并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。 凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進行育種。（二）準性雜交 類似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通過同一物種兩個不同菌株的體細胞發(fā)生融合，不經(jīng)過減數(shù)分裂而導致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。 為半知菌育種提供了一個重要手段。 存在范圍：常見于一些真菌尤其是半知菌中。,第四節(jié) 微生物育種

26、,利用微生物遺傳變異的特點，應(yīng)用誘變、雜交、原生質(zhì)體融合及基因工程等方法獲得所需的具有某些新型性狀菌種的操作稱為微生物育種。,包括： 誘變育種 原生質(zhì)體融合育種 基因工程育種等,1、誘變育種 是用物理或化學的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法

27、。,誘變育種具有極其重要的實踐意義。當前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。,一、誘變育種,2、誘變育種的步驟,原始菌種,純化,斜面/肉湯培養(yǎng),單孢子/單細胞懸液,誘變劑處理,平板分離,移至斜面,小試,中試,初篩,復篩,,,,,,,,,,,計算存活率,觀察形態(tài)變異，挑單菌落,良種保藏,原菌種特性鑒定,3、誘變育種的基本過程,選擇選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓

28、誘變處理↓篩選↓保藏和擴大試驗,二、原生質(zhì)體融合育種三、基因工程育種 本部分內(nèi)容自學，P120。,1.衰退（degeneration） ：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細胞形態(tài)的改變； 生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少； 抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。

29、代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；,第五節(jié) 菌種的衰退、復壯及保藏,一、菌種的衰退與復壯,2、菌種的復壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復原來優(yōu)良性狀。 狹義的復壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達到恢復該菌原有典型性狀的措施。 廣義的復壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能

30、逐步提高。實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。,菌種的復壯措施：①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細胞挑取法等）。 ②通過寄主體內(nèi)生長進行復壯（如Bacillus thuringiensis的復壯） ； ③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。④采用有效的菌種保藏方法。,3、防止菌種衰退的方法： ①控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復制過程中，堿基的錯配率是5x10

31、-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）； ②選擇合適的培養(yǎng)條件； ③采用不同類型的細胞進行傳代（對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進行接種）； ④采用有效的菌種保藏方法。,1. 目的：①存活，不丟失，不污染； ②防止優(yōu)良性狀喪失； ③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種。2. 原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)造降低微生物代謝活動強

32、度，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng) 以及添加保護劑等）。,二、菌種保藏,菌 連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種 種 生活態(tài) 傳代培養(yǎng)保藏法 連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種 保 固體斜面 藏

33、 濕法 半固體瓊脂柱 方 休眠態(tài) 液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管內(nèi) 吸附在合適的載體上,,,,,,3.菌種保藏的方法,菌種保存方法舉例：①低溫保藏法 方法：菌

34、種管置4℃冰箱保藏，定時傳代 原理：低溫下，微生物代謝強度明顯下降 。②石蠟油低溫保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。,③干燥保藏法 將菌種置于土壤、細紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時間幾至幾十年。,④真空冷凍干燥法 加有保護劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥。 適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時間長，是目前最好的保藏方法。⑤液氮超低

35、溫保藏法 將菌種置于保護劑中，預(yù)凍后保存在液氮超低溫冰箱中（-196℃）。 適用于各種微生物的較理想的保藏方法。,菌種保藏機構(gòu)的任務(wù)：廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。菌種保藏機構(gòu)： 中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM) 美國的典型菌種保藏中心(ATCC) 英國國家典型菌種保藏所（NCTC） 法國里昂巴斯德