質(zhì)粒抽提原理及詳細(xì)操作步驟

1、質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提實(shí)驗(yàn)室必備技能之一實(shí)驗(yàn)室必備技能之一質(zhì)粒質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒抽提粒抽提從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用強(qiáng)堿液、加熱或溶菌酶（主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌）可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和TritonX100（一般很少使用）可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton

2、X100處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA）的兩條鏈不會(huì)相互分開。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，

3、重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。質(zhì)粒抽提最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高、適用面廣、快速和純度高等特點(diǎn)。當(dāng)然，堿裂解法也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性。要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。堿裂解法抽提堿裂解法抽提質(zhì)粒需要用到以下三種溶液粒需要用到以下三種溶液溶液溶液Ⅰ03向離心管中加入250μl溶液Ⅰ（加入RNaseA），吹勻菌沉淀并將懸液轉(zhuǎn)移至新1.5mLEP管中；注意注意：菌體懸浮不完全會(huì)導(dǎo)致裂解不完全

4、，質(zhì)粒提取量和純度會(huì)降低。04向EP管中加入250μl溶液Ⅱ（裂解Buffer），溫和翻轉(zhuǎn)EP管610次，使菌體充分裂解，液體變得澄清濃稠（開蓋拉絲）；注意注意：所用時(shí)間不宜超過5min，以免質(zhì)粒被破壞；切勿劇烈震蕩；液體未變得澄清，則表明裂解不充分，可適當(dāng)減少菌體量或增大Buffer使用量；若溶液Ⅱ出現(xiàn)渾濁，可37℃水浴幾分鐘，待液體恢復(fù)澄清即可使用。05向EP管中加入350μl溶液Ⅲ，溫和翻轉(zhuǎn)EP管610次，此時(shí)可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色