血紅素氧合酶-1對缺氧引起腸黏膜損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　腸道不僅是營養(yǎng)物質消化和吸收的重要場所，而且還具有內分泌功能、免疫調節(jié)和黏膜屏障功能。其中腸黏膜屏障是維持腸道正常功能的基礎，在嚴重創(chuàng)傷、急性胰腺炎、大面積燒、腹部手術、出血性休克、彌漫性腹膜炎、腸梗阻等應激狀態(tài)下，腸黏膜的結構和功能受到損傷，導致腸黏膜屏障功能遭到破壞，通透性增強，進而引起細菌和內毒素的移位，造成腸源性感染，引起全身器官功能的損害。腸道不僅是多器官功能障礙綜合癥(multiple organs dys

2、function syndrome，MODS)的靶器官，而且還被認為是MODS的“動力部位”。血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase，HO-1)是一種誘導型酶，在休克、缺氧、感染、缺血-再灌注、重金屬離子等應激狀態(tài)的刺激下可誘導HO-1表達。HO-1是催化血紅素分解代謝的限速酶，分解血紅素產生一氧化碳(carbon monoxide，CO)、膽綠素(biliverdin)和游離鐵離子(Fe2+)。研究證實，HO-1及其代謝產物參與

3、機體的許多生理和病理過程，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和細胞保護作用。因此，我們推測:HO-1對腸黏膜屏障同樣具有保護作用。本研究通過建立體外腸上皮黏膜屏障模型，通過觀察緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的分布和表達的變化對腸黏膜屏障功能的影響，旨在證實HO-1對腸上皮細胞緊密連接的保護作用，并進一步闡述HO-1的部分作用機制，為臨床上治療腸道疾病提供理論依據和新的治療策略。
　　方法:
　　建立人Caco-2細胞體外腸上皮

4、細胞屏障模型，建立細胞缺氧模型和HO-1基因干預模型。細胞缺氧模型中，細胞分為四組，常氧組，分別缺氧4h、8h、12h組。構建人血紅素氧合酶-1基因真核過表達載體即pShuttle-CMV-HO-1，脂質體法轉染Caco-2細胞。HO-1基因干預模型細胞分為四組，①常氧組（常規(guī)培養(yǎng)）;②缺氧組（1％的O2培養(yǎng)8h）;③轉染組(pShuttle-CMV-HO-1+1％的O2培養(yǎng)8h);④質粒對照組（pShuttle-CMV+1％的O2培養(yǎng)

5、8h）。采用實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測各組腸上皮細胞Occludin、ZO-1、HO-1的mRNA和蛋白的表達水平變化。免疫熒光法觀察Occludin、ZO-1分子在細胞內的分布情況。應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析進行組間比較。
　　結果:
　　(1)免疫熒光結果:常氧組Occludin、ZO-1蛋白沿細胞膜分布，緊密排列呈線性熒光，

6、邊緣光滑，細胞之間聯系緊密;缺氧組、質粒對照組邊緣粗糙，甚至崩解斷裂，細胞間出現間隙;HO-1基因轉染組破壞減輕，邊緣呈連續(xù)性。
　　(2) RT-PCR、Western Blot的檢測結果顯示:缺氧可引起緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表達水平降低，隨著缺氧時間的延長，緊密連接蛋白的表達水平逐漸下降;HO-1基因轉染Caco-2細胞后，可以促進緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表達。