[學(xué)習(xí)]分子生物學(xué)研究策略-基因表達(dá)技術(shù)

1、分子生物學(xué)研究策略,3、基因分子生物學(xué)的基本技術(shù) 3.1 基因的分子雜交技術(shù) 3.2 基因的擴(kuò)增技術(shù)（PCR） 3.3 基因的突變技術(shù)（轉(zhuǎn)座技術(shù)） 3.4 基因的表達(dá)技術(shù) （表達(dá)系統(tǒng)） 3.5 轉(zhuǎn)基因技術(shù) （轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、 轉(zhuǎn)基因植物） 3.6 微陣列分析,**基因表達(dá)系統(tǒng),1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)3、乳酸菌基因

2、表達(dá)系統(tǒng)4、鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)5、酵母菌表達(dá)系統(tǒng)6、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)7、昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)8、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)9、植物生物反應(yīng)器,1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expression system in E.coli）,1）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 的特點(diǎn)：（1）遺傳背景清楚（2）目的基因表達(dá)水 平高（3）培養(yǎng)周期短（4）抗感染能力強(qiáng),2）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì),完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)；重組蛋白質(zhì)的正

3、確折疊；構(gòu)象形成；蛋白質(zhì)的分泌；菌體表面表達(dá)技術(shù)及其應(yīng)用；重組蛋白質(zhì)修飾加工。,真核基因在不同表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá),表達(dá)白細(xì)胞介素IL-3(成熟蛋白) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 20-30u 地衣芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 250-300u 酵母菌表達(dá)系統(tǒng) 20u 哺如動(dòng)物細(xì)胞 2u,2、芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expressio

4、n system in Bacillus）,1）特點(diǎn)枯草芽孢桿菌是非致病的土壤微生物，嚴(yán)格生長(zhǎng)在有氧條件下?？莶菅挎邨U菌遺傳學(xué)相當(dāng)先進(jìn)，很多噬菌體和質(zhì)粒適合用作克隆載體。芽孢桿菌可大量產(chǎn)生幾種商品酶，如?-淀粉酶，蛋白酶及蘇云金桿菌的殺蟲(chóng)晶體蛋白等，發(fā)酵技術(shù)發(fā)達(dá)。具有單層細(xì)胞膜組成較簡(jiǎn)單的細(xì)胞外殼。 易于分離純化分泌蛋白,2）枯草桿菌宿主菌株 由于大腸桿菌的CaCl2轉(zhuǎn)化法對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)效（1）選擇可轉(zhuǎn)化的菌株

5、 *168菌株及突變體： 營(yíng)養(yǎng)要求、芽孢形成和萌發(fā)、蛋白酶缺失、重組缺陷、限制/修飾系統(tǒng)缺陷、轉(zhuǎn)座子插入（2）選擇轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn)化：甘氨酸添加培養(yǎng)感受態(tài)其它方法，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合轉(zhuǎn)移,3）、可作為宿主的其它菌種：嗜堿芽孢桿菌Bacillus abcalophilus 蛋白酶淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefacilus ?-淀粉酶短芽孢桿菌Bacil

6、lus brevis地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis 淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 淀粉酶短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 蛋白酶,球形芽孢桿菌Bacillus sphaericus 滅蚊毒素蛋白嗜熱芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus 高溫?-淀粉酶蘇云金芽孢桿菌Bacillus thur

7、ingiensis 殺蟲(chóng)晶體蛋白耐堿的芽孢桿菌Bacillus alcalophilic 堿性蛋白酶炭疽芽孢桿菌 Bacillus anthracis,4）枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì),1、表達(dá)真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制劑 2、表達(dá)商業(yè)用酶 克隆基因的整合 3、表達(dá)殺蟲(chóng)晶體蛋白 提高殺蟲(chóng)毒力，減少殺蟲(chóng)時(shí)間，增加廣譜 4、利

8、用芽孢桿菌基因工程技術(shù)擴(kuò)大和加 強(qiáng)在醫(yī)藥領(lǐng)域多個(gè)方面的應(yīng)用,3、乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expression system in Lactic Acid Bacteria）,1）特點(diǎn)：乳酸菌指發(fā)酵糖類(lèi)主要產(chǎn)物為乳酸的一類(lèi)無(wú)芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱(chēng)。大多數(shù)不運(yùn)動(dòng)，少數(shù)以周毛運(yùn)動(dòng)。菌體常排列成鏈。在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱(chēng)為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙酸、乙醇、CO２等物質(zhì)的稱(chēng)為異型乳

9、酸發(fā)酵。有微好氧菌和專(zhuān)性厭氧菌。,Lactic Acid Bacteria,Genera:StreptococcusLeuconostocPediococcusLactobacillusEnterococcusLactococcus,All the above genera growin chains.Many are used for the foodindustry.,2）理想乳酸菌表達(dá)載體的特征：1、穩(wěn)定的遺

10、傳、傳代能力（復(fù)制子）2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記（Emr ）3、啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控4、具有多克隆酶切位點(diǎn),3）研究進(jìn)展,（1）食品發(fā)酵方面的應(yīng)用,（2）乳酸菌菌種鑒定REA （Restriction Endonuclease Analysis）16S rRNA （PCR ）SDS-PAGE,（3）抗微生物和食品腐敗,（4）細(xì)胞表面層和外多糖利用生物異構(gòu)化方法從亞油酸生產(chǎn)具有生理活性的共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體單體。篩選

11、到一株產(chǎn)生9順,11反共軛亞油酸的乳桿菌L1，建立了亞油酸制備技術(shù)，CLA小試發(fā)酵工藝，共軛亞油酸的HPLC純化分離和毛細(xì)管電泳鑒定技術(shù)。,（5）蛋白質(zhì)降解、多肽降解和脂降解,（6）分子遺傳學(xué)基因克隆表達(dá)調(diào)控染色體分析,（7）益生菌（PROBIOTICS） Lactobacillus and Bifidobacterium,食品級(jí)基因修飾菌是指被導(dǎo)入源于同種或公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物的基因，因此具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵

12、食品生產(chǎn)的微生物。1、功能性基因必須源于同種菌或公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物；2、載體必須是食品級(jí)的，不得含有非食品級(jí)的功能性DNA 片段；3、選擇性標(biāo)記不得選用各種抗生素抗性標(biāo)記。應(yīng)選用食品級(jí)的標(biāo)記基因，如糖類(lèi)利用標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記等；4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定，具有足夠的安全性，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。,食品級(jí)載體不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作為選擇標(biāo)記，因而更

13、為安全，在食品、醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。乳酸菌的食品級(jí) 高效誘導(dǎo)分泌表 達(dá)NICE系統(tǒng)是可 控制的蛋白質(zhì)生 產(chǎn)的最理想的系 統(tǒng)。,4、鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expression system in Streptomyces ）,1）特點(diǎn)大多數(shù)來(lái)自于土壤能形成孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌有復(fù)雜的形態(tài)（以無(wú)中隔分 枝菌絲方式生長(zhǎng)）和生理生 命周期產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物基因組是

14、大腸桿菌的兩倍， GC含量高，平均為74%,2）鏈霉菌的載體（1）高拷貝載體 pIJ101 40-800 拷貝 硫鏈絲菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel）（2）低拷貝載體 pIJ920 1-2拷貝 廣泛宿主 能插入大于30kb的片段 （3）穿梭載體 pHJL210（SCP2*/pBR322） （4）柯斯載體（cosmid） 構(gòu)建基因文庫(kù),（

15、5）接合轉(zhuǎn)移載體 pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（轉(zhuǎn)移功能）（6）噬菌體載體 ?C31衍生的，如KC304， KC505（7）表達(dá)載體 利用PtipA啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體 pIJ6021（8）分泌載體 利用S.longisporus 分泌的枯草桿菌素抑制劑subtilisin（SSI）分泌和抑制絲氨酸蛋白酶特性構(gòu)建 如pIJ702,（9）其他載體（A

16、）大容量載體 細(xì)菌人工染色體BAC 利用F因子復(fù)制起始點(diǎn)/par元件，1-2拷貝，克隆100-300kb的片段（B）整合型載體 利用pSAM2整合元件構(gòu)建的pPM927（C）高表達(dá)載體 整合高表達(dá)載體pCJR24，是利用天藍(lán)色鏈霉菌A3中的激活調(diào)節(jié)基因actII-ORF4與actI基因啟動(dòng)子構(gòu)建的,3）鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移的方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化率不高 ,制備過(guò)程中影響因素多,系統(tǒng)對(duì)外源DN

17、A的限制修飾作用（2）接合轉(zhuǎn)移 DNA以單鏈形式進(jìn)入宿主菌 大腸桿菌S17-1菌株, 質(zhì)粒RSF1010（3）電脈沖穿孔 轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體高10-100倍（4）噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo),4）鏈霉菌基因的調(diào)控和蛋白質(zhì)的分泌表達(dá),（1）RNA聚合酶基因多樣性 天藍(lán)色鏈霉菌有兩種不同形式的RNA聚合酶全酶 ?32 （與大腸桿菌有保守性）和?49 （發(fā)育階段）多? 因子,雙啟動(dòng)子 研究表明天藍(lán)色鏈霉菌至少有7個(gè)不同

18、的? 因子,參與營(yíng)養(yǎng)期,孢子形成,次級(jí)代謝等,（2）調(diào)節(jié)基因A、途徑專(zhuān)一調(diào)節(jié)基因（pathway specific regulator）具有鏈霉菌調(diào)節(jié)蛋白新家族(SARP)正調(diào)控因子B、全局調(diào)節(jié)基因（global regulator）調(diào)控所有抗生素生物合成的調(diào)節(jié)基因absA 編碼雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（3）調(diào)節(jié)因子 小分子脂溶兼水溶的γ丁酰內(nèi)酯作為激素樣物質(zhì)激發(fā)次級(jí)代謝和/或氣生菌絲的形成,（4）鏈霉菌中的蛋白外泌系統(tǒng)

19、蛋白分泌機(jī)制大多數(shù)鏈霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N端信號(hào)序列，它們的外泌依靠Sec-介導(dǎo)的分泌系統(tǒng)?，F(xiàn)已從鏈霉菌中已克隆了SecA，SecY，SecD，SecE和SecF類(lèi)似物。SecA(Blanco etal.1998)屬于膜相關(guān)的轉(zhuǎn)位ATPase,它阻止分泌前蛋白形成三級(jí)結(jié)構(gòu)前體，促進(jìn)前蛋白定位于分泌的轉(zhuǎn)位酶上。,蛋白的轉(zhuǎn)位和穿膜鏈霉菌中蛋白的轉(zhuǎn)位與穿膜機(jī)制尚未搞清，如將IL-2與tendamistat信號(hào)肽融合，在鏈霉菌中只有1/

20、20翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)位（translocation）至培養(yǎng)基和積累在胞內(nèi)。,5）影響鏈霉菌中基因表達(dá)的因素,（1）啟動(dòng)子對(duì)外源基因表達(dá)的影響（2）信號(hào)肽對(duì)外源蛋白分泌的影響A、信號(hào)肽N末端氨基酸序列正電荷數(shù)對(duì)基因表達(dá)的影響B(tài)、信號(hào)肽切割位點(diǎn)后的氨基酸數(shù)對(duì)基因表達(dá)的影響C、信號(hào)肽和目的蛋白之間的距離對(duì)基因表達(dá)的影響,（3）密碼子、SD序列和終止子等對(duì)基因表達(dá)的影響鏈霉菌中翻譯起始密碼子為ATG或GTG，終止密碼子為T(mén)AA或TAG（4

21、）DNA擴(kuò)增序列對(duì)基因表達(dá)的影響（5）發(fā)酵條件對(duì)外源基因表達(dá)的影響,6）鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)及研究發(fā)展趨勢(shì),（1）優(yōu)點(diǎn)：鏈霉菌工業(yè)化培養(yǎng)條件成熟,適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化鏈霉菌基本為非致病菌,不產(chǎn)生內(nèi)毒素可以進(jìn)行高密度培養(yǎng),在穩(wěn)定期仍能維持異源蛋白的產(chǎn)生鏈霉菌可分泌胞外酶,利用信號(hào)肽可分泌外源蛋白鏈霉菌中有許多可利用的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào),利用它可以高表達(dá)外源基因,（2）缺點(diǎn)：由于研究鏈霉菌表達(dá)有生物活性的真核來(lái)源的蛋白還處于初級(jí)階段,

22、許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果不具有普遍規(guī)律,存在的問(wèn)題有下列方面高活性啟動(dòng)子信號(hào)肽切割位點(diǎn)的氨基酸序列蛋白酶的水解次級(jí)代謝可控制啟動(dòng)子翻譯后加工,（3）研究發(fā)展趨勢(shì)結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué),完善基因表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化組合強(qiáng)啟動(dòng)子,信號(hào)和先導(dǎo)肽, 從分子水平研究其結(jié)構(gòu)元件與功能的關(guān)系在蛋白水平研究蛋白的分泌機(jī)理,特別是蛋白的轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)膜機(jī)制研究次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成酶系的結(jié)構(gòu),構(gòu)建新化合物文庫(kù),用于新藥的開(kāi)發(fā),5、酵母菌表達(dá)系統(tǒng)（Gene Exp

23、ression system in Yeast ）,*1996年，完成了酵母基因組DNA（1.25x107bp)全序列測(cè)定工作。,Division: buddingDo not form filamentsSome form filamentsSome can mate.,1）酵母菌基因表達(dá)系統(tǒng)的宿主特點(diǎn)： （1） 安全無(wú)毒, 不致病。 （2）有較清楚的背景,容易遺傳操作。 （3）容易進(jìn)行載體DNA的導(dǎo)入。

24、 （4）培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行高密度發(fā) 酵。 （5）有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。 （6）有類(lèi)似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯 后的修飾功能。,2）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,釀酒酵母是最早發(fā)展的真核基因表達(dá)系統(tǒng)。已表達(dá)和生產(chǎn)乙型肝炎疫苗、人胰島素、干擾素等。釀酒酵母的不足之處：（1）發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生乙醇，乙醇的積累會(huì)影響酵母本身的生長(zhǎng)，

25、因此較難進(jìn)行高密度發(fā)酵。 （2）蛋白質(zhì)的分泌能力較差。 （3）雖然能進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化修飾，但是與高等真核生物的相比，所形成的糖基側(cè)鏈太長(zhǎng)。  過(guò)度的糖基化會(huì)引起副作用。,3）畢赤酵母（Pichia pastoris）,優(yōu)點(diǎn)：（1）可以使發(fā)酵密度達(dá)到很高的水平；（2）分泌外源基因表達(dá)產(chǎn)物的能力強(qiáng)；（3）糖基化修飾功能更接近高等真核生物。不足：分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，要對(duì)其進(jìn)行遺傳改造困難較大；不是一種食品

26、微生物，發(fā)酵時(shí)又要添加甲醇，所以要用它來(lái)生產(chǎn)藥品或食品還沒(méi)有被廣泛接受。發(fā)酵雖然能達(dá)到很高的密度，發(fā)酵周期一般較長(zhǎng)。,4）酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展,（1）外源基因在酵母中的高表達(dá)（A）提高和控制外源基因的轉(zhuǎn)錄水平 *強(qiáng)啟動(dòng)子：磷酸甘油酸激酶基因的啟動(dòng)子 （pgk1） *營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子：碳源調(diào)控的gal1，gal10 基因，無(wú)機(jī)磷 調(diào)控的poh5基因 *溫控調(diào)節(jié)啟動(dòng)子：sir3基因,（B）提高表達(dá)載體的

27、在細(xì)胞的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性*酵母菌的內(nèi)源質(zhì)粒：野生型2µ質(zhì)粒*核糖體DNA：rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合*單拷貝DNA片段：HIS4或AOX1介導(dǎo)（C）提高外源基因在酵母系統(tǒng)表達(dá)水平的其它因素蛋白質(zhì)分泌的調(diào)控翻譯效率；酵母偏愛(ài)密碼子；蛋白酶降解；發(fā)酵密度,（2）提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的的質(zhì)量（A）表達(dá)系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性（B）胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的加工和修飾（C）分泌表達(dá)產(chǎn)物的加工和修飾（3）酵母表達(dá)系統(tǒng)的新應(yīng)用（A）酵母表

28、達(dá)系統(tǒng)在人類(lèi)基因組研究中應(yīng)用 (a）人類(lèi)基因的功能分析（b）人類(lèi)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜分析（c）人類(lèi)分泌蛋白質(zhì)和受體基因的快速篩選（B）酵母表達(dá)系統(tǒng)在藥物研究中的應(yīng)用,6、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expression system in Filamentous Fungi）,1）載體特點(diǎn)：天然質(zhì)粒，多數(shù)為線性，僅在粗糙鏈孢霉發(fā)現(xiàn)有環(huán)狀質(zhì)粒。目前使用的載體還是以細(xì)菌質(zhì)粒為基本結(jié)構(gòu)。 1、營(yíng)養(yǎng)選擇性標(biāo)記：argB （

29、精氨酸原養(yǎng)型）和 amdS （乙酰胺利用） 2、顯性選擇性標(biāo)記：G418（氨基糖苷類(lèi)抗生素） 3、啟動(dòng)子：從真菌基因組中篩選強(qiáng)啟動(dòng)子, 如cbh1（纖維素生物水解酶）gpd（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,轉(zhuǎn)化方法：（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 裂解酶Novozyme234，或與?-葡萄醛酸糖苷酶混合使用；滲透壓穩(wěn)定劑（如氯化鎂等無(wú)機(jī)鹽或山梨醇、蔗糖等糖）；聚乙二醇（PEG） 轉(zhuǎn)化率低，僅為10-30轉(zhuǎn)化子/ug DNA（2）電

30、擊轉(zhuǎn)化 ?-葡萄醛酸糖苷酶預(yù)處理，電擊條件，12.5kV/cm, 電容25 ? F,電阻400?。（3）共轉(zhuǎn)化 兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化在絲狀真菌中有較高的整合頻率。一個(gè)質(zhì)粒攜帶目的基因，另一個(gè)有篩選標(biāo)記 。所篩選的轉(zhuǎn)化子中90%含有目的基因。,2）基因的結(jié)構(gòu)和功能,真菌的核通常為單倍體核，基因組小，約為大腸桿菌的7倍，酵母菌的2倍，僅為人類(lèi)基因組的1%（一）基因轉(zhuǎn)錄（1）5’非編碼區(qū)： 核心啟動(dòng)子單元,（2）CAAT保守序列 較高

31、等的真核生物中，常在位于-80bp處，發(fā)現(xiàn)GC（C/T）CAATCT保守序列，絲狀真菌常位于-100～-200bp區(qū)。（3）TATA保守序列常位于轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)上游-40～-100bp,（4）CT含量豐富區(qū)常位于-10～-60bp （平均-20bp）（5）轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)通常有2個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)（6）轉(zhuǎn)錄加工和翻譯帽子結(jié)構(gòu)（Cap），A?U?G?C5‘-端不翻譯mRNA約5～300bp，通常30～70bp,,,,,CAAT

32、,TATA,CT,,tsp,,ATG,（7）內(nèi)含子68%的絲狀真菌的基因含有內(nèi)含子大多數(shù)的拼接位點(diǎn)5‘端 GTPuNGPy 3’ 端 PyAG（8）3’非編碼區(qū) PolyA寡聚物,3）次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),（一）β-內(nèi)酰胺抗生素 青霉素、頭孢菌素C（1）、生物合成基因克隆和調(diào)控研究 （A)編碼ACV合成酶的基因acvA(pcbAB)（?-氨基己二

33、酸-半胱氨酸-頡氨酸合成酶） 葡萄糖調(diào)控，磷酸鹽調(diào)控，銨調(diào)控（B）異青霉素N合成酶基因ipnA(pcbC),（C）異青霉素N:?；?輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(IAT)的基因aatA(penDE)（D）脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶/羥化酶(DAOC/DAC)雙功能基因cefEF （E）編碼乙?；?CoA:DAC乙?；D(zhuǎn)移酶的基因cefG,(2)、應(yīng)用(A)增加基因量提高產(chǎn)量(B)引入血紅蛋白基因增加抗生素產(chǎn)量(C)工程菌直接合成

34、7-ACA或7-ADCA（二）多肽代謝物具有抗微生物和其他藥理學(xué)活性如：線狀多肽—由綠色木霉產(chǎn)生的丙甲菌素,4）發(fā)展趨勢(shì),1、通過(guò)基因工程技術(shù)改良絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)，擴(kuò)大遺傳背景的深入了解。2、研究絲狀真菌自身的自我復(fù)制序列，提高DNA轉(zhuǎn)化率。3、研究轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和翻譯后加工的調(diào)控，增加產(chǎn)量。4、研究代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)關(guān)鍵點(diǎn)，最大限度的表達(dá)次級(jí)代謝產(chǎn)物，胞外酶，外源蛋白,昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)是一類(lèi)應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有同大

35、多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。利用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)系統(tǒng)，而另一類(lèi)新型的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，則是建立在對(duì)果蠅等昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)之上的，在穩(wěn)定性和表達(dá)效率方面有著更為突出的優(yōu)點(diǎn)。,7、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expression system in Insect Cells）,目前使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)了許多外源基因，例如：H5N1亞型禽流感病

36、毒血凝素、人骨形成蛋白2、人類(lèi)細(xì)小病毒B19殼蛋白VP2，人尿激酶原cDNA、信號(hào)肽引導(dǎo)源基因等?？贵w分子有鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、單鏈抗體及人單克隆抗體等多種抗體分子，還將抗體分子與尿激酶型纖溶酶原激活物等腫瘤相關(guān)蛋白進(jìn)行了融合表達(dá)，這些抗體分子多數(shù)能正確組裝，完成糖基化過(guò)程，具有相當(dāng)?shù)幕钚浴?1）昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能 為高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的

37、環(huán)境，可使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。 能進(jìn)行翻譯后的加工修飾 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行完整的翻譯后加工，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號(hào)肽切除及肽段的切割和分解等，修飾的位點(diǎn)與天然蛋白在細(xì)胞內(nèi)的情況完全一致。,表達(dá)水平高 與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)就是能獲得重組蛋白高水平的表達(dá)，最高可使目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50%。 能容納大分子的插入片段 桿狀病毒粒子可以擴(kuò)大，并能包裝大的基因片段，但目

38、前尚不知桿狀病毒所能容納的外源基因長(zhǎng)度的上限。 能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的能力。既可采用不同的重組病毒同時(shí)感染細(xì)胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時(shí)克隆兩個(gè)外源基因，表達(dá)產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。對(duì)脊椎動(dòng)物安全,3）昆蟲(chóng)桿狀病毒的一般概念,（1）昆蟲(chóng)桿狀病毒 是已知昆蟲(chóng)病毒中的最大類(lèi)群，是研究最多、實(shí)用意義最大的昆蟲(chóng)病毒。它們是很多昆蟲(chóng)病的病原，如家蠶的膿

39、病，同時(shí)也是農(nóng)林主要害蟲(chóng)的控制因子，對(duì)它的研究具有重要的意義，目前對(duì)桿狀病毒的研究日益廣泛和深入。,（2）桿狀病毒的分類(lèi)桿狀病毒因其病毒粒子呈桿狀而得名。桿狀病毒科（Baculoviridae）分為①包含體桿狀病毒亞科(Eubaculoverinae),又稱(chēng)真桿狀病毒亞科；②非包含體桿狀病毒亞科(Nudibaculoverinae)。包含體桿狀病毒亞科根據(jù)其包含體的多少和形態(tài)分為核型多角體病毒屬（Nuclear Polyhed

40、rosis Virus，NPV）和顆粒病毒屬（Granulosis Virus，GV）,NPV屬按囊膜內(nèi)核衣殼數(shù)目的多少分成1）單粒包埋核型多角體病毒（SNPV）代表種：家蠶核型多角體病毒（BmNPV）2）多粒包埋核型多角體病毒（MNPV）代表種：苜蓿尺蠖核型多角體 病毒（AcMNPV）自從1983年Summers等人構(gòu)建了第一個(gè)AcMNPV重組病毒表達(dá)外源基因以來(lái)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分子生物學(xué)及應(yīng)用研究取得了飛速發(fā)展。,（3

41、）桿狀病毒的基因結(jié)構(gòu)以AcMNPV為例桿狀病毒基因組是共價(jià)閉合環(huán)狀的dsDNA，其基因組全長(zhǎng)134kb，共有337個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中可以編碼多肽的區(qū)段共有137個(gè)。 生理?xiàng)l件下，DNA與富含Arg的堿性蛋白結(jié)合，此DNA－蛋白復(fù)合體由39KD的衣殼蛋白組成的外被所包圍，形成一個(gè)核殼體。若干個(gè)核殼體外面在包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。幾個(gè)病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質(zhì)中成為一個(gè)多角體包含體。,（4）桿狀病毒表達(dá)載體昆蟲(chóng)桿狀病

42、毒表達(dá)載體系統(tǒng) 通常由轉(zhuǎn)移載體、親本病毒和重組介質(zhì)三部分組成。其技術(shù)路線分以下幾步: （A）將外源片段克隆到載體質(zhì)粒中，置于桿狀病毒啟動(dòng)子控制之下，上下游各有一段與親本病毒DNA 相匹配的側(cè)翼序列，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體；（B）把轉(zhuǎn)移載體和野生型病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞，通過(guò)同源重組將外源片段插入到病毒基因組，以特定的篩選標(biāo)記和方法獲得重組病毒。（C）當(dāng)重組病毒在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)，外源片段也得到了表達(dá)。最后空斑純化重組病毒，擴(kuò)大培養(yǎng)，分離、純

43、化所表達(dá)的外源蛋白。,轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建由于AcMNPV基因組的巨大，不可能用單一的限制性酶切位點(diǎn)來(lái)對(duì)它進(jìn)行操作，所以目前使用的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體（transfer vector）。將病毒非必需基因polh基因克隆到一個(gè)大腸桿菌質(zhì)粒中，利用限制性?xún)?nèi)切酶和DNA外切酶或者PCR的方法，除去部分或全部polh基因編碼序列，保留完整的啟動(dòng)子部分和多角體基因下游序列，即多角體基因側(cè)翼序列，之間加入單一或者多克隆位點(diǎn)，可以插入

44、外源基因。,桿狀病毒分子量大，不能象質(zhì)粒載體一樣利用多克隆位點(diǎn)進(jìn)行基因重組，而只能利用桿狀病毒和帶有目的基因序列的質(zhì)粒載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。以野生型桿狀病毒ＤＮＡ(ＡＣＭＮＰＶ)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時(shí)重組率極低,僅有0 .1%.,,利用線形化的病毒載體可將重組率提高到30%。在部分載體中引入了β-半乳糖苷酶基因后可以利用插入失活結(jié)合藍(lán)白斑進(jìn)行重組體的篩選。BaculogoldTM是一種缺失衣殼蛋白編碼序列ＯＲＦ1629部分序列的缺失致死型突變體,此ＤＮ

45、Ａ與基于多角體蛋白位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時(shí),只有發(fā)生同源重組的病毒才有復(fù)制能力.,果蠅表達(dá)系統(tǒng)( Drosophila expression system ，DES)包含表達(dá)載體和相應(yīng)的選擇載體。通過(guò)表達(dá)載體和選擇載體的共轉(zhuǎn)染, 可在3～4 周時(shí)間內(nèi)獲得表達(dá)重組蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系. 而且通過(guò)優(yōu)化表達(dá)載體和選擇載體的比例, 可以得到含有高拷貝數(shù)目的基因的細(xì)胞系, 從而提高目的蛋白的表達(dá)量。,以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆

46、蟲(chóng)細(xì)胞中復(fù)制，不能在其他昆蟲(chóng)細(xì)胞(如果蠅細(xì)胞)中復(fù)制，然而研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動(dòng)子幾乎不發(fā)生作用，利用的是果蠅啟動(dòng)子如Hsp70啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白5C啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等，其中，Hsp70啟動(dòng)子的作用最強(qiáng)。重組桿狀病毒感染果蠅細(xì)胞后不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒-果蠅系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。,4）昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)

47、和重組蛋白表達(dá),（1）昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件所有的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有基本鹽類(lèi)，糖類(lèi)，氨基酸，有機(jī)酸，維生素以及微量元素。通常用的商品培養(yǎng)基有Grace培養(yǎng)基，呈粉狀。配制培養(yǎng)基的時(shí)候要加入10％胎牛血清（FBS）和酵母水解物（YL）和水解乳蛋白（LH）昆蟲(chóng)細(xì)胞一般在27℃生長(zhǎng)最佳，培養(yǎng)基pH是6.2，無(wú)需CO2。多數(shù)昆蟲(chóng)細(xì)胞的倍增時(shí)間是18－22h,,（2）昆蟲(chóng)細(xì)胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞比較容易在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模水平上（10

48、0－1000ml），在磁力攪拌瓶中生長(zhǎng)，其密度一般可以達(dá)到3×106/ml，活力在95％以上。氧的供給：在成批培養(yǎng)的密閉容器中需解決通氧，而且在培養(yǎng)感染重組病毒的昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)耗氧量比未感染的要高。細(xì)胞保護(hù)：由于昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)于剪切力和產(chǎn)生氣泡的敏感性，細(xì)胞容易破裂，化合物PluronicF－68可以保護(hù)細(xì)胞因上述原因造成的損傷。其它因素：還有好多因素要考慮，如反應(yīng)器的設(shè)計(jì)，細(xì)胞密度，培養(yǎng)基成分，病毒感染的條件等。,,（3）病毒

49、感染和基因表達(dá) 由于昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白是一種間歇性的程序進(jìn)行生產(chǎn)的，因?yàn)樗屑?xì)胞都會(huì)因病毒感染而引起病理性死亡，因此，在生產(chǎn)時(shí)往往需要至少有兩個(gè)反應(yīng)器：第一個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)正常的昆蟲(chóng)細(xì)胞，第二個(gè)反應(yīng)器用于病毒接種感染表達(dá)。,利用桿狀病毒的極早期基因ie基因啟動(dòng)子構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，由于病毒極早期基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄可以直接利用宿主細(xì)胞的RNA polymerase II，所以用這樣的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)細(xì)胞，使昆蟲(chóng)細(xì)胞能夠持續(xù)表達(dá)

50、外源蛋白。,5）桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的新應(yīng)用,（1）廣泛用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)各種重組蛋白。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)于20世紀(jì)80年代初期問(wèn)世以來(lái)，在20多年的時(shí)間里已成為生產(chǎn)與研究各種原核、真核蛋白有力而普及的工具。,（2）用于桿狀病毒表面的蛋白展示，建立蛋白庫(kù)，簡(jiǎn)化單克隆抗體的純化和蛋白與受體相互作用的研究。 有潛力的應(yīng)用是病毒表面的蛋白展示功能（protein display）。將外源基因插入到桿狀病毒表面糖蛋白gp67

51、的信號(hào)肽與成熟蛋白編碼序列之間，不破壞它本身的轉(zhuǎn)運(yùn)及膜融合功能，從而作為載體將外源蛋白展示在病毒粒子表面。,（3）構(gòu)建含有哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的重組桿狀病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，作為良好的基因轉(zhuǎn)移載體，用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。 桿狀病毒可以被非宿主細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞所吞飲，但是不能在非宿主細(xì)胞中復(fù)制。帶有哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的重組桿狀病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞，并表達(dá)報(bào)告基因。根據(jù)桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的特點(diǎn)，作為基因傳遞載體

52、，可以將帶有p53基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Saos－2 human osteosarcoma細(xì)胞，100％的轉(zhuǎn)化細(xì)胞都能表達(dá)p53基因，這就為體內(nèi)利用基因治療法治療癌癥等疾病提供了途徑。,盡管昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)存在一些不足之處，但它在農(nóng)業(yè)、基礎(chǔ)分子生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有極其重要的作用。利用不斷發(fā)展的新技術(shù)將其改造為較高效的殺蟲(chóng)劑仍然具有極其誘人的前景。另外，隨著對(duì)這一表達(dá)系統(tǒng)本身的基礎(chǔ)理論研究的不斷深入，其調(diào)控機(jī)理也將越來(lái)越清晰明了，

53、新的調(diào)控因子及強(qiáng)的增強(qiáng)子也可能被找到，這將極大地提高蛋白的表達(dá)效率。,8、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（Gene Expression system in Mammals）,1）特點(diǎn)糖基化等翻譯后修飾。能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類(lèi)型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白。,2）表達(dá)載體,病毒載體：以病毒顆粒的方式，通過(guò)病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用

54、的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(SFV)載體等。,3）高效表達(dá)載體構(gòu)建,（1）轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 （A）利用病毒源性和細(xì)胞源性的強(qiáng)啟動(dòng)子，如mCMV、hCMV、hEF-lα、人的c-fos、雞胞漿-β肌動(dòng)蛋白等啟動(dòng)子。CMV啟動(dòng)子在細(xì)胞處于S期、生長(zhǎng)迅速時(shí)，轉(zhuǎn)錄活性最高；但在大規(guī)模生產(chǎn)的中、后期，外源基因的表達(dá)水平下降。此時(shí)，pEF-1 α啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始效率更強(qiáng)。,（B）利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件構(gòu)建雜

55、合啟動(dòng)子Masayuki等發(fā)現(xiàn)CMV增強(qiáng)子能提 高h(yuǎn)EF-1 α啟動(dòng)子控制下的目的基因表達(dá)量4-9倍 。Kim等發(fā)現(xiàn)將hEF-1 α啟動(dòng)子的第1個(gè)內(nèi)含子置于mCMV啟動(dòng)子與目的基因(熒光素酶)之間能極大地提高目的基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)，使熒光素酶的表達(dá)量提高了8.2倍。,（C）提高宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表 達(dá)水平EGF能提高EF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄量和蛋白質(zhì)的表達(dá)。Reza等將用作結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域-鋅指結(jié)構(gòu)

56、和VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建了人工轉(zhuǎn)錄激活因子，將CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率提高了2倍多。,（2）翻譯水平的調(diào)控 mRNA壽命、mRNA的翻譯起始效率和翻譯產(chǎn)物的加工修飾的效率等也對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)生重要的影響。（A）內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)能使 同一mRNA中除第1個(gè)基因之外 的其他基因也得到有效表達(dá)。（B）翻譯增強(qiáng)子可提高翻譯效率。（C）使用宿主細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子來(lái)

57、 對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。,（3）整合位點(diǎn)的優(yōu)化目的基因在CHO細(xì)胞染色體上整合位點(diǎn)區(qū)域的狀態(tài)對(duì)于目的基因的表達(dá)與否、表達(dá)高低以及目的基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性起著決定性的作用。只有那些整合位點(diǎn)處于染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細(xì)胞形成的克隆才可高水平表達(dá)目的基因。,（A）選擇基因(如 neo)的弱化表達(dá)，使大量整合在低表達(dá)整合位點(diǎn)的細(xì)胞由于選擇標(biāo)記基因表達(dá)量不夠而在選擇培基條件下死亡。（B）在載體上添加染色體上的某些特定

58、序列(如骨架/基質(zhì)附著區(qū))，使表達(dá)載體整合到宿主細(xì)胞的染色體后能模擬染色體的高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)。,3）宿主細(xì)胞,常用的幾種用于表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株BHK-21細(xì)胞 CHO-K1細(xì)胞C127細(xì)胞 MDCK細(xì)胞Namalwa細(xì)胞 Vero細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞 COS細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞株(如Sp2/0和J558L) 不同的細(xì)胞對(duì)重組蛋白的修飾可能會(huì)稍有差別。,發(fā)現(xiàn)新細(xì)胞株：

59、 來(lái)源于Madin-Darby犬腎的高分化內(nèi)皮細(xì)胞株(MDCK)，表達(dá)分泌型的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP13。高表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆可占轉(zhuǎn)染細(xì)胞的5％～l0％，而同樣的載體在CHO細(xì)胞中僅得到低水平的表達(dá)。,對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞株進(jìn)行遺傳改造： 基于腺病毒E1A蛋白可反式激活CMV啟動(dòng)子，Cockett等建立了穩(wěn)定表達(dá)E1A的CHO細(xì)胞株，在該細(xì)胞中重組前膠原酶的產(chǎn)量與CHO細(xì)胞相比增加了12倍。,4)常用的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(1)CHO/DHFR和

60、CHO/NEOSPLA 表達(dá)系統(tǒng)（2）C127/BPV-1系統(tǒng)（3）骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),5）表達(dá)系統(tǒng)方式,（1）瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)：宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達(dá)時(shí)限短暫。簡(jiǎn)捷，實(shí)驗(yàn)周期短，規(guī)模大。技術(shù)條件要求高，如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等。,（2）穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)：載體進(jìn)入宿主細(xì)胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)持久、穩(wěn)定。由于需抗性選

61、擇甚至加壓擴(kuò)增等步驟，穩(wěn)定表達(dá)相對(duì)耗時(shí)耗力。,（3）誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)：目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導(dǎo)后才得以開(kāi)放。早期—糖皮質(zhì)激素、重金屬離子—特異性低、毒性高。近年—非哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的調(diào)控蛋白—外源基因表達(dá)低、誘導(dǎo)效應(yīng)高。,6）基因的導(dǎo)入方法光穿孔法 沖擊波法基因槍法 穿孔法磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體法抗體轉(zhuǎn)染法 其他,7）展望

62、（一）改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量 1.采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子 2.更好地利用擴(kuò)增系統(tǒng)獲尋找高表達(dá)位點(diǎn) 3.采用和改造更好的宿主細(xì)胞（二）利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本 1.采用“代謝工程”改造工程細(xì)胞 2.改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本（三）抑制細(xì)胞調(diào)亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（四）采用“糖基化”工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量,9、植物生

63、物反應(yīng)器（Plant Bioreactor）,植物生物反應(yīng)器是指通過(guò)基因工程途徑，以常見(jiàn)的農(nóng)作物作為“化學(xué)工廠”，通過(guò)大規(guī)模種植生產(chǎn)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類(lèi)及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法。,1）植物生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn),植物生物反應(yīng)器的廉價(jià)性植物生物反應(yīng)器的安全性植物具有真核生物的加工修飾能力植物生產(chǎn)系統(tǒng)的實(shí)用性,2）植物生物反應(yīng)器的生產(chǎn)流程,目前，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)

64、器生產(chǎn)藥用蛋白的領(lǐng)域方向主要有三個(gè)：一是藥用蛋白，二是醫(yī)用抗體，三是疫苗。 原理是將目的基因?qū)胫参?，使其在植物中表達(dá)，人或動(dòng)物攝取該植物或其中的蛋白后達(dá)到預(yù)期目的。,3）植物反應(yīng)器的載體系統(tǒng),4）植物遺傳轉(zhuǎn)化方法,載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,基因直接轉(zhuǎn)化,病毒載體,農(nóng)桿菌質(zhì)粒,鳥(niǎo)槍法,PEG介導(dǎo),,,,,,形成愈傷組織進(jìn)而完整的轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)化率高，但外源基因穩(wěn)定性差,“裸露細(xì)胞”，全能性易操作，效率高，但遺傳穩(wěn)定性更差，周期長(zhǎng),花粉細(xì)胞、

65、卵細(xì)胞 單倍體培養(yǎng)或利用受精過(guò)程導(dǎo)入較強(qiáng)的接受外源DNA能力，但受季節(jié)限制,5）植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng),幾點(diǎn)關(guān)鍵問(wèn)題基因表達(dá)的有效性 啟動(dòng)子的選擇—組成型啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒（CaMV）的35啟動(dòng)子，活性高且能穩(wěn)定表達(dá)。 信號(hào)肽—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽（SP）、C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列等 標(biāo)記序列—C-myc、組蛋白等2. 基因表達(dá)的穩(wěn)定性 不斷選擇高水平表達(dá)外源蛋白量的株系； 選

66、擇具有良好貯藏功能的器官作為植物反應(yīng)器的表達(dá)部位,3、重組蛋白的純化 口服疫苗—不需要精確的提純 基因融合—定向引導(dǎo)重組蛋白于特定細(xì)胞器或組織，簡(jiǎn)化提純步驟 4、重組產(chǎn)物的特性 糖基化模式的差別—去除N-糖基 5、大田生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 抗性基因，轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散，轉(zhuǎn)基因作物安全,6）植物生物反應(yīng)器的特點(diǎn),7）前景展望,隨著新功能基因的分離、克