薄層層析的原理與操作

1、薄層層析的原理與操作薄層層析的原理與操作薄層色譜，或稱薄層層析(thinlayerchromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動(dòng)相，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法，從50年代發(fā)展起來(lái)至今，仍被廣泛采用。一、基本原理一、基本原理薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板，也可用滌綸布

2、等)上形成薄層，然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開(kāi)。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。吸附是表面的一個(gè)重要性質(zhì)。任何兩個(gè)相都可以形成表面，吸附就是其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此表面上的密集現(xiàn)象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發(fā)生吸附

3、現(xiàn)象。物質(zhì)分子之所以能在固體表面停留，這是因?yàn)楣腆w表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。在固體內(nèi)部，分子之間相互作用的力是對(duì)稱的，其力場(chǎng)互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對(duì)稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體表面時(shí)受到這種剩余力的影響，就會(huì)被吸引而停留下來(lái)。吸附過(guò)程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來(lái)。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面

4、積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開(kāi)此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過(guò)程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同，使混合物得以分離。當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動(dòng)時(shí)，帶著樣品中的各組分一起移動(dòng)，同時(shí)發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對(duì)它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點(diǎn)。如作為標(biāo)準(zhǔn)的化合物在層

5、析薄板上一起展開(kāi)，則可以根據(jù)這些已知化合物的Rf值(后面介紹Rf值)對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)行鑒定，同時(shí)也可以進(jìn)一步采用某些方法加以定量。薄層層析有許多優(yōu)點(diǎn)：它保持了操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、顯色容易等特點(diǎn)，同時(shí)展開(kāi)速率快，一般僅需15～20分鐘混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既適用于只有0.01μg的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點(diǎn)是對(duì)生物高分

6、子的分離效果不甚理想。二、固定相支持劑的選擇和處理二、固定相支持劑的選擇和處理在薄層層析時(shí)，對(duì)支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質(zhì)與適用范圍二是支持劑的顆粒大小。一般來(lái)說(shuō)，所選吸附劑應(yīng)具有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對(duì)欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。吸附力的強(qiáng)弱規(guī)律可概括如下：吸附力與兩相間界面張力的降低成正比，某物質(zhì)溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反

7、比。極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向，例如，同系物極性遞減，而被非極性表面吸附的能力將遞增。三、薄層板制作三、薄層板制作薄層板制作簡(jiǎn)稱制板，是指作為固定相的支持劑被均勻地涂布在玻板上，形成一薄層。所用的玻板要求表面平滑、清潔。玻板的大小按需要選定，常用的規(guī)格為6cm20cm、20cm20cm及2.5cm7.5cm。1、軟板制作、軟板制作軟板也稱干板，是不加粘合劑，將支持劑干粉直

8、接均勻地鋪在玻板上制成的。這種薄層板制作簡(jiǎn)單，展開(kāi)快，但極易吹散。其具體制作方法如下：(1)選用直徑約為0.5cm的玻璃管一根，根據(jù)薄層的厚度(一般為0.4～1mm)在其兩端繞膠布數(shù)圈。(2)將支持物干粉倒在玻板上，固定玻板一端以防玻璃推進(jìn)時(shí)移動(dòng)。(3)將玻璃管壓在玻板上，將支持劑干粉由一端推向另一端即成薄層。2、硬板制作、硬板制作硬板或稱濕板，是將支持劑加粘合劑和水或其他液體后，均勻地鋪在玻璃板上，再經(jīng)烘干而成的薄層板。制作方法可用專

9、門的薄層制板器，也可用手工，均能得到滿意的效果。下面介紹三種手工涂布制板的方法：(1)玻棒涂布將支持劑用水或適當(dāng)溶劑調(diào)成膠漿，倒在玻板上，然后依軟板制作相同方法，用玻棒在玻板上將支持劑由一端向另一端推動(dòng)，即成薄層。(2)玻片涂布在玻板兩旁放置兩塊稍厚的玻板，把支持劑膠漿倒在中間的玻板上，然后用另一塊玻片的邊緣將膠漿刮向另一端，即成一定厚度的薄層。干燥后用刀刮去薄板兩側(cè)的支持劑。更換玻板兩旁不同厚度的玻片，即可調(diào)節(jié)薄層的厚度。(3)傾斜涂

10、布將支持劑膠漿倒在玻片上，然后將玻板傾斜，使膠漿均勻涂布于玻板上。上述任何一種方法將支持劑均勻涂布于玻板上后，靜置片刻，待薄層表面無(wú)水漬后，置烘箱中，讓溫度升到100℃，持續(xù)1小時(shí)。關(guān)閉電源，待溫度降至接近室溫時(shí)，取出薄層板，放入干燥器備用。此一步驟稱為活化。四、點(diǎn)樣四、點(diǎn)樣點(diǎn)樣是將經(jīng)處理后的樣品點(diǎn)加在薄層的特定部位，這是一項(xiàng)需要十分仔細(xì)的操作步驟，點(diǎn)樣的好壞會(huì)直接影響分離效果。點(diǎn)樣可用玻璃毛細(xì)管，如作定量測(cè)定，應(yīng)使用微量移液管或微量注

11、射器，市售血球計(jì)數(shù)管經(jīng)加工磨尖頭部并標(biāo)定體積后使用也甚理想。點(diǎn)樣的位置，上行展開(kāi)法一般點(diǎn)樣在離薄層下端4～5cm處，下行展開(kāi)法在離上端6～8cm處。如作雙相紙層析分離，點(diǎn)樣處應(yīng)位于距薄層右側(cè)邊5cm與距底邊5cm直線的交點(diǎn)。薄層層析點(diǎn)樣方法應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)樣品最好用具揮發(fā)性的有機(jī)溶劑(如乙醇、氯仿等)溶解，不應(yīng)用水溶液，因水分子與吸附劑的相互作用力較弱，當(dāng)它占據(jù)了吸附劑表面上的活性位置時(shí)，就使吸附劑的活性降低，而使斑點(diǎn)擴(kuò)散。(2)