南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院侯金林

1、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 侯金林,乙型肝炎血清學(xué)診斷新進(jìn)展,肝功（LFT）血清標(biāo)志物HBV DNAYMDD,,,,,,,,,,cccDNA,HBV mRNA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,高爾基體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依賴聚合酶,RNA依賴聚合酶,胞核,肝細(xì)胞,,,,,,,,,,

2、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBsAg,HBeAg,,,,HBV DNA,,血 清,,,,,耐藥突變,,,,,,,,,,cccDNA,HBV mRNA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,高爾基體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依賴聚合酶,RNA

3、依賴聚合酶,胞核,肝細(xì)胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBsAg,HBeAg,,,,HBV DNA,血 清,耐藥突變,HBsAg 我們了解什么?,HBsAg – 最老標(biāo)志， 經(jīng)典，簡(jiǎn)單?易檢測(cè)，難清除未知不少: 清除機(jī)理？半衰期？,EM,,,回歸血清學(xué)?,,量,基因型/亞型變異體肝組織/血清濃度的比例,HBsAg定量檢測(cè)：i2000的缺點(diǎn),檢測(cè)范圍窄：0.

4、05-250 IU/ml；,稀釋步驟：手工，耗時(shí) ；,大部分樣品需要稀釋后重新測(cè)定,大部分樣品需要稀釋后測(cè)定,HBsAg定量檢測(cè)的應(yīng)用,一、了解影響血清HBsAg水平的因素,二、了解抗病毒治療下血清HBsAg的 動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn),HBsAg與HBV DNA水平正相關(guān),B基因型的HBsAg水平更高,獨(dú)立影響血清HBsAg水平：HBV DNA 和基因型,基因型C: 肝內(nèi)HBsAg水平更高,HBV/C: HBsAg轉(zhuǎn)運(yùn)障礙？,

5、基因型→HBsAg轉(zhuǎn)運(yùn)→臨床結(jié)局？,基因型C感染,肝內(nèi)HBsAg滯留,肝細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子引起的損傷更敏感 1,,,HBsAg轉(zhuǎn)運(yùn)障礙？,肝細(xì)胞表面內(nèi)源性肽高水平遞呈 2,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力（ER stress)增高 3,基因C型患者肝臟損傷更嚴(yán)重,,,,,,1, Kalinina, et al. Hepatology, 20012, Gilles, et al. Hepatology, 19923, Xu, et al. J Virol, 1

6、997,HBsAg動(dòng)態(tài)變化,研究目的HBV 復(fù)制持續(xù)抑制時(shí)HBsAg的動(dòng)態(tài)變化,HBsAg的動(dòng)態(tài)變化,入選標(biāo)準(zhǔn)HBeAg陽(yáng)性拉米夫定長(zhǎng)期治療，之前無(wú)抗HBV治療；病毒抑制快速：治療24周HBV DNA陰性病毒抑制持久：HBV DNA陰性持續(xù)至156周,基線資料,HBsAg動(dòng)態(tài)變化特征與HBeAg轉(zhuǎn)陰與否無(wú)關(guān),基因型影響HBsAg的變化特點(diǎn),個(gè)體患者HBsAg變化的主要類型,,,,,,,,,,cccDNA,HBV mRNA,

7、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,高爾基體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依賴聚合酶,RNA依賴聚合酶,胞核,肝細(xì)胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBsAg,HBeAg,,,,HBV DNA,血 清,耐藥突變,HBeAg定量檢

8、測(cè),亞培公司曾經(jīng)提供過(guò)HBeAg定量檢測(cè)服務(wù)，但目前沒有商品化的HBeAg定量試劑,,,,,,,,Fig 3,,,,,,,,,,cccDNA,HBV mRNA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,高爾基體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依賴聚合酶,RNA依賴聚合酶,胞核,肝細(xì)胞,,,,,,,,,,,

9、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBsAg,HBeAg,,,,HBV DNA,血 清,耐藥突變,HBV cccDNA,HBV共價(jià)閉環(huán)(covalently closed circular, ccc)DNA是前基因組(pg)RNA合成的模板。是病毒復(fù)制的模板, 其數(shù)量決定病毒復(fù)制水平, 宿主免疫控制肝細(xì)胞的cccDNA數(shù)量, 肝內(nèi)病毒復(fù)制和清除強(qiáng)度的平衡表現(xiàn)為血清病毒水平。,HBV cccD

10、NA的定量,均依據(jù)松弛環(huán)狀DNA和cccDNA在結(jié)構(gòu)上的差異而設(shè)計(jì)，一些報(bào)告還采取酶消化的附加步驟以減少松弛環(huán)狀DNA相對(duì)于cccDNA的比例以增加特異性 過(guò)高估計(jì)cccDNA水平, 有些方法甚至可以檢測(cè)到血清中極高拷貝數(shù)的HBV cccDNA,不準(zhǔn)確,不標(biāo)準(zhǔn),不實(shí)用,HBV cccDNA的定量檢測(cè)方法在特異性的提高上仍有空間；同時(shí)采用目前的HBV cccDNA定量方法可能會(huì)對(duì)HBV生活周期的認(rèn)識(shí)以及抗病毒治療的策略制定產(chǎn)生誤導(dǎo)

11、，值得警惕肝臟活檢的不普遍性，HBV cccDNA定量的臨床應(yīng)用目前仍不現(xiàn)實(shí)。,,,,,,,,,,cccDNA,HBV mRNA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,高爾基體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依賴聚合酶,RNA依賴聚合酶,胞核,肝細(xì)胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

12、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBsAg,HBeAg,,,HBV DNA,,血 清,HBV DNA 檢測(cè),斑點(diǎn)雜交 （Dot-blot hybridization）,非PCR定量（Non-PCR based quantitative HBV DNA assays,定量 PCR-based quantitative HBV DNA assays,1980s1990s2000s,,,血清HB

13、V DNA定量,方法目前多以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）作為檢測(cè)手段；HBV DNA定量的表達(dá)多以拷貝/毫升（copies/ml）或國(guó)際單位/毫升（IU/ml）表達(dá)，二者之間粗略的換算方法為1 IU/ml = 5 copies/ml。血清HBV DNA定量檢測(cè)的發(fā)展方向?yàn)楦呙舾行裕╯ensitivity）和更寬的動(dòng)態(tài)范圍（dynamic range）。,Minor fluctuation或minor rebound,例如羅氏公司的

14、Cobas Taqman（敏感性為60IU/ml，動(dòng)態(tài)范圍可至108IU/ml)，目前剛完成或正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)多采用此方法，并將HBV DNA下降速率作為療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。亞培公司的RealTime方法的檢測(cè)范圍與前者類似，檢測(cè)下限可達(dá)10 IU/ml。更早地監(jiān)測(cè)到接受抗病毒治療患者血清HBV DNA的波動(dòng)甚至是反彈（minor fluctuation或minor rebound），,不同試劑HBV DNA檢測(cè)范圍,,1021

15、031041051061071081091010,Ultrasensitive Digene II,Cobas Amplicor,Versant HBV DNA 3.0,HBV DNA (copies/ml),Digene II,bDNA,NAXCOR,Cobas TaqMan,,,國(guó)產(chǎn)試劑盲區(qū),國(guó)產(chǎn)試劑盲區(qū),(無(wú)天, 無(wú)地,無(wú)標(biāo),無(wú)法,),HBV 標(biāo)準(zhǔn)品,HBV DNA levels determined by diff

16、erent tests cannot be compared directlyWHO standard – genotype A Eurohep standard (IU/ml),,,,,,High prevalence of genotype recombinations in China,,,,,,,N=1096; from 9 centers,Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang

17、 ZH J General Virology 2005,C,B,B,C,B,C, C/D, D,,,,,,,C:77%,B: 59%,B: 23%,C:41%,D,C/D 29%,B, C 71%,,C6, C7?,Different geographical distribution of subgroups of HBV genotype C in China (n=526),Wang ZH. J Viral Hepatitis 2

18、007; Wang ZH J General Virology 2005,Chan H. J Infect Dis. 2005,Prevalence of subgenotype C in China,,,,N=534; from 9 centers,,,,,,,,,,C2: 99%,C1: 1%,,,C1: 55%,C2: 45%,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,10,20,30,40,50,6

19、0,70,80,Ba,C1,C2,,PC,,BCP,P<0.001,49/134 35/134,5/106 83/106Cs,14/45 24/45Ce,37,5,31,26,78,53,Wang ZH. JCM 2007; Wang ZH J General Virology 2005,HBV Genotypes and subgenotypes in China,,,,,Pure B(Bj strain),

20、Pure D,C/D Hybrid(C6),Pure C(C1, C2),B/C hybrid(Ba strain),,,,,EcoR I site,HBV Genome,0,3200,,,Genotypes,S,PreC/C,nt1742 2495,,nt10 799,,For Genotyping,,,ayw,adr,ayw,adw,a

21、dw,Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005,,nt10 1499,,ayw,C/D Hybrid(C7),,,,,HBV Genotypes and subgenotypes in China,,,,,Pure B(Bj strain),Pur

22、e D,C/D Hybrid(C6),Pure C(C1, C2),B/C hybrid(Ba strain),,,,,EcoR I site,HBV Genome,0,3200,,,Genotypes,S,PreC/C,nt1742 2495,,nt10 799,,For Genotyping,,,ayw,adr,ayw,adw,adw,

23、Zeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005,,nt10 1499,,ayw,C/D Hybrid(C7),,,,Ox head and body but horse face (牛頭馬面),,,,,,,CD B C

24、 D,Inner Mongolia,Mongolia,Xinjiang,5.1%,INDIA,Geographical location and HBV genotypes distribution in different regions of western China,Ethnical distribution of CD hybrid in Western regions,Tibetan 81%,Han 19%,H

25、ui (Gansu) 57% Hui (Ningxia) 15%,Uygur 5%,,,,,,,,,,cccDNA,HBV mRNA,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,高爾基體,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,HBV 復(fù)制周期(Replication cycle of HBV),DNA 依賴聚合酶,RNA依賴聚