動物細(xì)胞工程ppt課件

1、,,動物細(xì)胞工程,世界生物醫(yī)藥發(fā)展概況,自上世紀(jì)90年代以來，生物醫(yī)藥市場增速一直都維持在全球藥品市場增速的2-3倍。以2007年為例，全球生物技術(shù)藥物年銷售額同比增長12.5%，總額突破750億美元，這一增速是2007年全球藥品市場增速（6.4%）的兩倍?？贵w藥物是近年來增長率最快的生物技術(shù)藥物，全球年銷售額從1997年的3.1億美元上升到2007年的270億美元，十年內(nèi)增長了87倍?？贵w藥物在生物藥物產(chǎn)業(yè)中所占份額也從2000年的

2、1/5上升到2007年的1/3，且年均增長12.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全球制藥行業(yè)6%的增長水平。經(jīng)濟(jì)學(xué)家們預(yù)計2007～2012年的抗體藥物年平均銷售額增長率將保持在14%左右，實際超過預(yù)計。,Epogen (EPO, 促紅細(xì)胞生成素)Humulin（胰島素）Intron-A (α-IFN, α-干優(yōu)素) Engreix-B (乙肝疫苗)Cerezyme (葡萄腦苷脂酶)Activase (t-PA, 組織纖維蛋白溶酶原激活劑)

3、Humatrope (hGH, 生長激素)Reopro (抗Gpllb/IIIa抗體)Avonex (IFNβ-la, β-la干擾素) Protropin/Nutropi (somatrem/somatropin) Pulmozyme (α-鏈球菌DNA酶) Proleukin (IL-2,白介素-2) Leukine (GM-CSF, 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子),早期上市的主要生物技術(shù)產(chǎn)品,,由培養(yǎng)動物細(xì)胞產(chǎn)生的部分藥

4、品產(chǎn)品 臨床用途 產(chǎn)生細(xì)胞干擾素 癌癥、病毒感染 Namalwa干擾素 癌癥、病毒感染 CHO EPO

5、 貧血 CHOtPA 溶血栓 CHOVIII因子 血友病

6、 CHO乙肝表面抗原 疫苗 CHO人生長激素 侏儒癥 CHOGCSF 化療解救 CHO

7、單抗OKT3 腎移植 雜交瘤,,,,當(dāng)前的生物技術(shù)研究前沿,,,,,,,,,生物醫(yī)藥學(xué)科綜合,治療性抗體,組織工程技術(shù),生物藥遞送技術(shù),RNAi藥物,基因治療,天然藥物合成生物學(xué),干細(xì)胞治療,新型疫苗,2010年全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu),IMS Health Market prognosis,生物醫(yī)藥在全球前十大藥品中的排名,

8、Global Pharmaceutical Market Review & World Top Ten/Twenty Drugs 2008,,,美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)或即將批準(zhǔn)的治療性抗體藥物,,,,,在我國批準(zhǔn)上市的國外單抗藥物,在中國批準(zhǔn)上市的國產(chǎn)單抗藥物,,,動物細(xì)胞工程基本概念 應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)原理和方法（細(xì)胞融合或基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等），通過某種工程學(xué)手段（遺傳操作等），在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的

9、意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品（特定的蛋白制品）的一門綜合科學(xué)技術(shù)。,單克隆抗體,細(xì)胞融合,細(xì)胞培養(yǎng),胚胎移植(提高產(chǎn)仔率),核 移 植(克隆牛、羊等),,,,,,動物細(xì)胞工程,一、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器 生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物、細(xì)胞）所具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或細(xì)胞反應(yīng)器等。動物細(xì)胞生物反應(yīng)器近年來得到迅速的發(fā)展，利用動物細(xì)胞可以準(zhǔn)確、有

10、效地生產(chǎn)醫(yī)藥生物技術(shù)制品，如活性肽、單抗、細(xì)胞因子、生長因子等。,利用動物細(xì)胞生物反應(yīng)器產(chǎn)生蛋白的必要性1．細(xì)菌和酵母系統(tǒng)產(chǎn)生哺乳動物蛋白并不另人滿意，主要原因是該系統(tǒng)不一定能產(chǎn)生完全正確的哺乳動物蛋白。2．動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)往往經(jīng)過一系列翻譯后修飾，才能成為成熟蛋白，而微生物系統(tǒng)不一定能實現(xiàn)翻譯后修飾。3．翻譯后修飾因不同的蛋白而有差異，其中以糖基化最為常見，尤其對于分泌的蛋白更是如此，其他修飾也可發(fā)生。4．翻譯后修飾對某些

11、蛋白的活性是不可缺少的。修飾也將影響蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性、清除率，以及組織分布等。,蛋白翻譯后修飾的原因,蛋白活性調(diào)節(jié)的需要 蛋白相互作用的需要亞細(xì)胞水平定位的需要等,哺乳動物蛋白常見的翻譯后修飾—————————————————————————————————————————————————————糖基化 (glycosylation)谷氨酸的g-羧化 (g-carboxylation)門冬氨酸的b-羥化 (b-hydr

12、oxylation)磷酸化與硫酸化 (phosphorylation & sulphatation)蛋白水解加工 (proteolytic processing)酰胺化 (amidation)—————————————————————————————————————————————————————,還有：甲基化、乙?；⒓柞；⑹耐榛?、異戊二烯基化、氨基化–去氨基化、二硫鍵形成、硝化等共兩百多種類型。,蛋白質(zhì)翻譯后修

13、飾,主要內(nèi)容:泛素化糖基化磷酸化乙?；谆?泛素化在生命過程中的作用,泛素化是泛素與其他蛋白結(jié)合，并進(jìn)一步降解蛋白的過程。 對于細(xì)胞分化、細(xì)胞器的合成、細(xì)胞凋亡、DNA 修復(fù)、新蛋白的合成、調(diào)控細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)運輸?shù)壬磉^程都起到很重要的作用。,蛋白糖基化的作用,糖基化在生物過程中起著重要作用，如免疫保護(hù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞生長、細(xì)胞之間黏附、炎癥的產(chǎn)生等。,糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成的大部分蛋白是糖

14、蛋白,蛋白磷酸化的作用,可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生、新陳代謝、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化等作用。,蛋白的乙酰化作用,組蛋白的乙?；腿ヒ阴；腔虮磉_(dá)過程中重要的調(diào)控方式，是轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵修飾。組蛋白去乙?；竿ㄟ^去除組蛋白的乙?；推渌D(zhuǎn)錄調(diào)控參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。,組蛋白的乙?；阴；鰪?qiáng)轉(zhuǎn)錄去乙?；种妻D(zhuǎn)錄,,蛋白甲基化的作用,組蛋白上的甲基化，不僅在真核細(xì)胞染色

15、質(zhì)的遺傳外修飾中占有中心地位，對細(xì)胞分化、發(fā)育、基因表達(dá)、基因組穩(wěn)定性及癌癥研究均有深遠(yuǎn)的影響。其他類型的甲基化的異?；蚣谆傅耐蛔兂?dǎo)致疾病的發(fā)生。,動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的基本特征1．需要用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞融合等方法建立必要的生產(chǎn)細(xì)胞系；2．需要大量、高密度培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液與培養(yǎng)設(shè)備；3．需要控制細(xì)胞的生長與蛋白的表達(dá)；4．在產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)一些可能影響安全性的副產(chǎn)品，包括細(xì)胞碎片蛋白、 DNA、病毒等，需要在產(chǎn)品的純化

16、過程中加以清除；5．在細(xì)胞培養(yǎng)中，可出現(xiàn)對細(xì)胞有害的副產(chǎn)品，如氨離子、乳酸等，應(yīng)在培養(yǎng)液的組成以及培育條件等方面考慮限制這些毒性產(chǎn)物的釋放。,動物細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的問題1．產(chǎn)量低 與微生物系統(tǒng)比較，動物細(xì)胞重組蛋白的產(chǎn)量較低；2．生產(chǎn)設(shè)備與技術(shù)復(fù)雜 細(xì)胞生長慢，工藝條件要求高，易染菌；3．控制生產(chǎn)過程較困難 細(xì)胞生長速度與產(chǎn)物表達(dá)量的控制要求高；4．細(xì)胞在培養(yǎng)過程中易受損傷 動物細(xì)胞比微生物脆弱，培養(yǎng)條

17、件要求苛刻；5．產(chǎn)品純化困難 培養(yǎng)液中含有大量外源性蛋白，原材料的質(zhì)量不好控制，如血請等；6．成本較高 所用儀器設(shè)備、培養(yǎng)基等材料價格貴。,細(xì)胞工程在優(yōu)化細(xì)胞株過程中的應(yīng)用1．防止細(xì)胞凋亡 凋亡抑制方法，培養(yǎng)基補(bǔ)充，基因策略(bcl-2等)；2．代謝工程 通過代謝調(diào)控抑制乳酸鹽和氨水等毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生；3．分子伴侶工程 增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與蛋白分泌有關(guān)的分子伴侶蛋白數(shù)量；4．轉(zhuǎn)譯后加工工程(糖基化工

18、程) 通過合適的糖基轉(zhuǎn)移酶過表達(dá)達(dá)到此目的。,生物反應(yīng)器,生物反應(yīng)器在生物過程中起中心作用，是實現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵設(shè)備，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。,,細(xì)胞或酶等生物催化劑（游離或固定化）,生 物 反 應(yīng) 器,空氣,CO2等,冷卻水,原材料,培養(yǎng)基,滅菌,底物,產(chǎn)物,廢物,除菌,檢測和控制,產(chǎn)物預(yù)處理,產(chǎn)品提取或液化,副產(chǎn)物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,生物反應(yīng)器中復(fù)雜的相互關(guān)系,生物反應(yīng)器1．?dāng)嚢枋浇?jīng)典的動物細(xì)胞反

19、應(yīng)器；2．氣升式有氧傳遞速度大、傳熱效果及混合性能好；3．中空纖維管細(xì)胞密度大、血清用量小、細(xì)胞不易受損；4．流化床式比表面積大、適合培養(yǎng)各種細(xì)胞。,1．?dāng)嚢枋剑ɑ\式攪拌器）,2．氣升式（氣腔式反應(yīng)器）懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用,中空纖維反應(yīng)器：左右兩箭頭為無菌空氣進(jìn)出口。細(xì)胞生長在由半透性的多孔膜制成的中空纖維管外表面。,3．中空纖維管中空纖維貼壁反應(yīng)器,培養(yǎng)基出口,細(xì)胞,,,培養(yǎng)基入口,,,4．

20、流化床式流化床反應(yīng)器,基本原理是使支持細(xì)胞生長的微粒呈流態(tài)化。由膠原制成的微粒，具有像海綿一樣的多孔性，用非毒性物質(zhì)增加其比重，使之達(dá)到1.6 或更高，以便它在高速向上流動的培養(yǎng)波中里流態(tài)化。細(xì)胞接種于微粒中，通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動的培養(yǎng)液使之成為流化床，不斷提供給細(xì)胞必要的營養(yǎng)成分，細(xì)胞得以在微粒中生長。同時新鮮培養(yǎng)液不斷地被加入，培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物又不斷地被排除。,流化床、攪拌式、微載休培養(yǎng)細(xì)胞密度的對比,培養(yǎng)類型細(xì)胞類

21、型細(xì)胞密度(cell/mL)流化床貼壁依賴性 1.3 ×108流化床雜 交 瘤 0.3 ×108微載體攪拌釜貼壁依賴性 0.2-2 ×107恒化床雜 交 瘤 2.0 ×106,,,,二、動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)： 10代以內(nèi)的組織培養(yǎng)細(xì)胞

22、； 正常細(xì)胞： 10－50代未經(jīng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化細(xì)胞： 重組DNA進(jìn)入受體的過程叫“轉(zhuǎn)化”,得到重組DNA的細(xì)胞叫“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”；細(xì)胞系: 特定基因背景的無限傳代細(xì)胞，BHK-21, CHO-K1, MDCK, MRC-5, Namalwa, Vero, WI-38。,動物細(xì)胞培養(yǎng)過程,除單細(xì)胞原生動物外，細(xì)胞培養(yǎng)過程具有以下特性：① 細(xì)胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需用抗生素；② 動物細(xì)胞較微生

23、物大得多．無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；③ 培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌形成的較大流體剪切力：④ 在培養(yǎng)中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性：⑤ 培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，反應(yīng)過程成本較高，但產(chǎn)品價格昂貴；⑥ 大規(guī)模培養(yǎng)時，不可照用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗；⑦ 原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。,動物細(xì)胞培養(yǎng)特性,用于細(xì)胞培養(yǎng)的部分細(xì)胞系 細(xì) 胞來

24、 源用 途 COS非洲綠猴腎細(xì)胞小規(guī)模量單抗 CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)重組蛋白 BHK倉鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)畜用疫苗 MDCK狗腎細(xì)胞生產(chǎn)畜用疫苗 MRC-5人胚肺組織細(xì)胞產(chǎn)生人用疫苗 Namalwa淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞生產(chǎn)a-干擾素 Vero猴腎臟成纖維細(xì)胞生產(chǎn)人用制品 WI-38胚肺組織細(xì)胞生產(chǎn)人用疫苗,,,,細(xì)胞培養(yǎng)過程的

25、放大1．篩選細(xì)胞系2．確定培養(yǎng)條件3．產(chǎn)物表達(dá)的優(yōu)化4．中試放大5．放大生產(chǎn),細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境1．培養(yǎng)用品的無菌處理 器材、培養(yǎng)基、試劑等；2．培養(yǎng)條件 水質(zhì)、pH、滲透壓、溫度、空氣、攪拌速度。,細(xì)胞培養(yǎng)基 1．天然培養(yǎng)基： 血漿凝塊、血清淋巴液、胚胎浸液及羊水、腹水等。2．合成培養(yǎng)基： DMEM、RPMI 1640、Ham’s F12、IMDM等。包含氨基酸（氮源） 、糖

26、（碳源） 、鹽類、維生素、激素、生長因子、微量元素、脂等；10% 血清。,無血清懸浮培養(yǎng) 1．無血清培養(yǎng)基 可替代血清功能的生物材料配制細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等；2．無動物來源培養(yǎng)基 需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物；3．無動物蛋白培養(yǎng)基 部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物；4．化學(xué)組分限定培養(yǎng)基 最安全、最理想的培養(yǎng)基，可保證

27、培養(yǎng)基批次間一致性，少量動物來源蛋白水解物、蛋白都是成分明確。,常用培養(yǎng)方法1．懸浮培養(yǎng)2．貼壁培養(yǎng)3．微載體培養(yǎng)（葡聚糖）4．包埋和微囊培養(yǎng)（瓊脂糖、海藻酸鈣凝膠）,1. 貼壁培養(yǎng) 分散的細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)器中往往要貼附在壁上，這叫細(xì)胞貼壁。原來是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細(xì)胞就開始有絲分裂并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面，形成致密的細(xì)胞單層，叫做單層細(xì)胞，這種培養(yǎng)的方法又叫單層

28、細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中有一個非常有趣的現(xiàn)象是細(xì)胞的接觸抑制。當(dāng)貼壁生長的細(xì)胞生長到表面相互接觸時，就停止分裂增殖，長成單層的細(xì)胞經(jīng)過一段時間，一定須在重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代。2. 懸浮培養(yǎng) 是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長過程，主要用于懸浮生長的細(xì)胞培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由于動物細(xì)胞的特點，如沒有細(xì)胞壁保護(hù)，不能耐受劇烈的攪拌和通氣，因此在許多方

29、面又與經(jīng)典的發(fā)酵有所不同。對于小規(guī)程培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)多采用發(fā)酵罐式的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，有成熟的理論計算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗，放大效應(yīng)小。但是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度較低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險。此外，有許多動物細(xì)胞屬于貼壁依賴性的，不能懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵是要選擇適當(dāng)?shù)臄嚢韬屯庋b置。,3. 微載體培養(yǎng)系統(tǒng) 微載體是直徑為 60~250μm 的微珠。采用微裁體系統(tǒng)培

30、養(yǎng)動物細(xì)胞，細(xì)胞易壁于微載體上，微載體（和細(xì)胞）懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞在微載體表面逐漸生長成單層。這種模式把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點融匯在一起，具有兩種培養(yǎng)方法的優(yōu)點。 1)表面積/體積比大；2)由于微裁體懸浮于培養(yǎng)基中，是均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了細(xì)胞生長各種環(huán)境因素的監(jiān)測和控制，細(xì)胞生長環(huán)境亦均勻；3)培養(yǎng)基利用率高；4)采樣重演性好；5）收獲過程不復(fù)雜；6)放大較容易；7)勞動強(qiáng)度小，占用空間小。4. 包埋培養(yǎng)

31、 對懸浮生長和貼壁依賴生長的細(xì)胞都適用，細(xì)胞生長的密度高，抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)。對懸浮生長的細(xì)胞用海藻酸鈣包埋，對貼壁依賴生長細(xì)胞用膠原包埋。由于動物細(xì)胞培養(yǎng)慢而費用高，且對剪切力敏感，經(jīng)包埋后可有效的保護(hù)細(xì)胞。,5. 微囊化培養(yǎng) 在動物細(xì)胞微囊化制備中，主要是應(yīng)用海藻酸—聚氨基酸方法，簡單過程是動物細(xì)胞與海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最

32、后用檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動物細(xì)胞得以懸浮在其中。動物細(xì)胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是關(guān)鍵材料。微囊化方法能使細(xì)胞處于相對穩(wěn)定、受剪切力小的環(huán)境中，而養(yǎng)分和氧又可以從微囊外的培養(yǎng)液擴(kuò)散進(jìn)入。,1000L氣升式細(xì)胞反應(yīng)器系統(tǒng),細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1．分批式操作2．半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)）3．流加式操作（分批培養(yǎng)過程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基）4．連續(xù)罐流式操作（連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基）,分

33、批、連續(xù)、流加操作方式的比較,,4.因經(jīng)常滅菌會降低儀器使用壽命,大規(guī)模生產(chǎn)的操作1．培養(yǎng)基的配制2．種子細(xì)胞的制備3．雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)4．產(chǎn)品的分離純化5．產(chǎn)品的冷凍干燥,單批細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)時間,,,,,,,3.125ml,62.5ml,1.25L,,,,,,,,10kL,500L,25L,,,,,day16~20,day21~25,day11~15,day28~32,day1~5,day8~12,day6~10,da

34、y13~17,day18~22,day15~19,day20~24,day23~27,day25~29,day21~25,day30~34,day26~30,,,,儲槽10kL,day32,day25,,day26,day33,,,母細(xì)胞庫,生物產(chǎn)品生產(chǎn)工藝開發(fā)要素,動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用 1．獲得細(xì)胞產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)生物制品，包括病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等； 2．制備燒傷病人植皮所需的皮膚細(xì)胞； 3．獲得檢測用細(xì)胞，

35、檢測有毒物質(zhì)的毒性。,三、動物細(xì)胞的基因工程基因工程基本概念 在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。,高表達(dá)細(xì)胞株的建立基因轉(zhuǎn)染 選擇瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法，既取決于實驗的要求，同時經(jīng)濟(jì)和技術(shù)因素也可考慮在內(nèi)。1．基因瞬時轉(zhuǎn)染 常見于實驗室研究，瞬時轉(zhuǎn)

36、染跳過了通過細(xì)胞的鑒定與選擇來判斷質(zhì)粒整合至細(xì)胞基因組這一步，速度快。2．基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 用于臨床或商業(yè)目的，一個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能將目的基因DNA整合到宿主細(xì)胞染色體組中。,動物細(xì)胞的核酸轉(zhuǎn)移方法1．磷酸鈣沉淀法；2．DEAE－右旋糖酐法；3．脂質(zhì)體包被法；4．微量注射法；5．電脈沖法；6．基因槍；7．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。,1、化學(xué)法,磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過

37、細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低。Ca2(PO4)2+DNA → 混合微細(xì)顆粒 （Ca離子濃度 125 mmol， DNA 離子濃度 5～0ug/ml， PH 7.0）↓沉淀反應(yīng)20~30min↓細(xì)胞在沉淀物中暴露 5~24h,2、物理方法,電穿孔法（electroporotion） 將細(xì)胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿

38、孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。 瞬間 細(xì)胞 細(xì)胞膜核摸通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細(xì)胞,,,3、顯微注射法（microinjection ）

39、利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核中,Clone sheep Dolly體細(xì)胞 提取 核 重組細(xì)胞 回植 Dolly卵細(xì)胞 去核 細(xì)胞,,,,,,外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)1．降解2．游離狀態(tài)3．整合到宿主細(xì)胞的染色體,病毒表達(dá)載體

40、1．SV40病毒載體2．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體3．牛痘病毒載體4．牛乳頭瘤病毒載體5．腺病毒載體6．多瘤病毒7．Epstein-Barr virus, Sinbis virus 8．重組病毒載體等,細(xì)胞轉(zhuǎn)基因遺傳標(biāo)記的選擇系統(tǒng)1．二氫葉酸還原酶基因選擇系統(tǒng) (dhfr)2．胸苷激酶基因選擇系統(tǒng) (tk)3．新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (neo)4．氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (cat)5．綠色熒光蛋白基因 (gfp)特定的遺傳標(biāo)

41、志（基因）和相應(yīng)的選擇培養(yǎng)劑: MTX (dhfr), HAT (tk), 四環(huán)素 (tetr), 卡那霉素 (kanr) 和新霉素 (neo) 基因。,細(xì)胞株篩選1．傳統(tǒng)篩選方法 最常用的方法是有限稀釋克?。↙DC）；2．流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選 膜標(biāo)記技術(shù)，優(yōu)勢在于篩選數(shù)目大幅增加；3．基于細(xì)胞分泌率的高表達(dá)細(xì)胞的篩選 凝膠微液滴技術(shù)檢測，基于基質(zhì)的分泌檢測；4．細(xì)胞篩選的自動

42、化系統(tǒng) 激光激活分析和處理系統(tǒng)，自動挑選克隆， Cello系統(tǒng)。,四、雜交瘤技術(shù) 雜交瘤與單克隆抗體單克隆抗體與多克隆抗體比較的優(yōu)點1）高度特異性；2）同質(zhì)性；3）可工業(yè)化生產(chǎn)；4）高度可重復(fù)性；5）免疫原不一定要高度純化；6）可制備人源抗體。,動物細(xì)胞的融合方法,雜交瘤的制備方法免疫（immunization）↓細(xì)胞融合（cell fusion） ↓ PEG選擇（

43、selection） ↓ HAT培養(yǎng)基篩選（screening） ↓細(xì)胞克?。╟loning） ↓ 有限稀釋法抗體特征鑒定（characterization）↓細(xì)胞保存（storage）,,BioTechniques 2010,選擇1~2個初篩最好的抗體在靶選擇性細(xì)胞上進(jìn)行免疫印跡分析,是否有多條帶,是否陰性和陽性細(xì)胞都有,丟棄抗體,是否有

44、預(yù)期分子量條帶,免疫沉淀試驗,免疫熒光染色是否減弱,條帶是否被阻斷,組織芯片抗體效價分析,組織染色和特異性是否與已報道的一致,組化表達(dá)水平是否與 WB 或 IP 一致,反復(fù)分析鑒定,抗體的生產(chǎn)和產(chǎn)量是否可以被重復(fù),可以使用的抗體,siRNA下敲靶蛋白,丟棄抗體,丟棄抗體,丟棄抗體,是否有預(yù)期分子量條帶,,,,,,No,Yes,No,Yes,,,,,,,,,,No,No,,,No,,,Yes,,,,Yes,Yes,,No,,Yes,,Ye

45、s,,,No,No,,,,,Yes,No,,Yes,,單克隆抗體生產(chǎn)過程,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,注射抗原,單克隆抗體,,單克隆抗體的生產(chǎn)方法1．小鼠腹腔體內(nèi)生產(chǎn)2．生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)3．轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)生產(chǎn),單克隆抗體的應(yīng)用,1．醫(yī)學(xué)研究研究工具，如Western blot, Immunoprecipitation, ELISA等；信號傳導(dǎo)分子活性的阻斷或促進(jìn)劑，藥物篩選等。 2．純化蛋白利用單抗對抗原（目

46、的蛋白）的特異性結(jié)合性質(zhì)，制備蛋白純化柱。3．醫(yī)學(xué)診斷用于疾病的診斷，包括癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；4．疾病防治在疾病治療方面，包括惡性腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、器官移植 、感染性疾病等。,干細(xì)胞治療技術(shù),,,2010年5月美國FDA以孤兒藥核準(zhǔn)Osiris公司的干細(xì)胞藥物Prochymal用于 I 型糖尿病的治療。2012年5月加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)Prochymal用于治療兒童急性移植