蛋白質(zhì)復(fù)性方法

1、包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性包涵體表達(dá)的蛋白的復(fù)性摘要摘要綜述了包涵體形成、包涵體分離和溶解、包涵體折疊復(fù)性的方法、復(fù)性產(chǎn)率低下的主要因素以及通過(guò)分子伴侶、低分子量添加物等的應(yīng)用而提高了蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性AbstractStrategiesfdecreasingthefmationofinclusionbodiesisolationresolutionofinclusionbodiesrefoldingofinclu

2、sionbodyproteinsthecauseofdecreasedrefoldingyieldswereincluded.Renaturationyieldofrecombinantproteinhavebeenimprovedbyusingsomeadditivessuchasmolecularchaperonesmallmolecules.Keywdsinclusionbodyproteinrenaturation外源基因在大腸

3、桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對(duì)宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低而分子伴侶、低分子量添加物等在復(fù)性過(guò)程中的應(yīng)用及新的復(fù)性方法的建立都大大提高了重組蛋白質(zhì)復(fù)性產(chǎn)率。一、包涵體：1.1包涵體的定義、組成與特性：包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，

4、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.51um，具有很高的密度（約1.3mgml），無(wú)定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。[1]1.2包涵體的形成：主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過(guò)程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。1.2.1、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過(guò)高，超過(guò)了細(xì)菌正常的代謝水平，

5、由于細(xì)菌的δ因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過(guò)多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。1.2.2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說(shuō)含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵二、復(fù)性：由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理?xiàng)l件，使蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞

6、，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。通過(guò)緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開(kāi)始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開(kāi)始，到1.5M時(shí)復(fù)性過(guò)程已經(jīng)結(jié)束。2.1包涵體蛋白復(fù)性方法2.1.1稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過(guò)夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。2.1.2透

7、析復(fù)性：好處是不增加體積，通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度，有人稱易形成無(wú)活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無(wú)法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。2.1.3超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過(guò)程中不可逆的變性。2.1.4柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復(fù)性，大致可分成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)

8、性均是用Sephacry1S100或Superdex75等分子篩填料，柱較長(zhǎng)（40cm100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復(fù)性回收率高（高達(dá)90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)?。ㄒ话阄灞蹲笥遥5]2.1.5高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過(guò)程中或加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性；二是采用溫度跳躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋

9、白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速提高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質(zhì)的復(fù)性。2.2包涵體蛋白復(fù)性效率復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過(guò)程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之